( 一) 概述
离心机是借离心力分离液相非均一体系的设备。根据物质的沉降系数、质量、密度等的不同，应用强大的离心力使物质分离、浓缩和提纯的方法称为离心。一般说，
离心机转速在20 000r/min以上的称为超速离心。离心技术，特别是超速离心技术是分子生物学、生物化学研究和工业生产中不可缺少的手段。
1924年T.Svedberg和Rinde研制出世界上第一台涡轮超速离心机以来，发展非常迅速，现在已广泛地应用到科学研究和生产的各个领域。现在离心机转头最高转速已达100000 r/min，最大离心力达700 000 g。
离心机作为一种手段，具有许多优点。例如，超速离心可在低温下操作，保护了生物大分子的活性。制备型的离心机负载量大，一次可分离提纯几克样品，比层析、
电泳上的样品量大得多。分析离心机不仅可测物质的分子量，还可检验物质的纯度、构象、沉降系数等。因此离心技术在生物学研究中占有重要的地位，是分离、纯
化细胞、病毒、蛋白、核酸和酶的最方便最有效的工具。
(二) 离心原理
当含有细小颗粒的悬浮液静置不动时，由于重力场的作用使得悬浮的颗粒逐渐下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液体小的粒子就会上浮。微粒在重力场下移
动的速度与微粒的大小、形态和密度有关，并且又与重力场的强度及液体的粘度有关。象红血球大小的颗粒，直径为数微米，就可以在通常重力作用下观察到它们的
沉降过程。
此外，物质在介质中沉降时还伴随有扩散现象。扩散是无条件的绝对的。扩散与物质的质量成反比，颗粒越小扩散越严重。而沉降是相对的，有条件的，要受到外力
才能运动。沉降与物体重量成正比，颗粒越大沉降越快。对小于几微米的微粒如病毒或蛋白质等，它们在溶液中成胶体或半胶体状态，仅仅利用重力是不可能观察到
沉降过程的。因为颗粒越小沉降越慢，而扩散现象则越严重。所以需要利用离心机产生强大的离心力，才能迫使这些微粒克服扩散产生沉降运动。
离心就是利用离心机转子高速旋转产生的强大的离心力，加快液体中颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数和浮力密度的物质分离开。离心力(F)的大小取决于离心转头的角速度(ω，r/min)和物质颗粒距离心轴的距离(r，cm)。它们的关系是：F＝ω2R
为方便起见，F常用相对离心力也就是地心引力的倍数表示。即把F值除以重力加速度g (约等于9.8m/s2.)得到离心力是重力的多少倍，称作多少个g。例如离心机转头平均半径是6cm，当转速是60 000
r/min时，离心力是240 000×g，表示此时作用在被离心物质上的离心力是日常地心引力的24万倍。
因此，转速r/min和离心力g值之间并不是成正比关系，还和半径有关。同样的转速，半径大一倍，离心力(g值)也大一倍。转速(r/min)和离心力(g值)之间的关系可用下式换算：
式中：r为半径(cm)，g为离心力(g值)
(三) 转头和离心管
1. 转头 离心机的转头是放样品的地方。有以下4种类型：
(1)水平转头也称吊篮式转头。静止时离心管垂直挂在转头上，当转头转速达600r/min后达到水平位置，通常一个转头挂3个或6个吊篮。用水平转头离
心时，样品沉降方向是顺管子的轴向移动的，最后沉降在管底。便于收集，但由于转头结构复杂，最高转速相对要低，容量也小一些。
(2)角转头 转头的离心管腔与转轴保持20-30度的固定角度。由于结构稳定，可装载较多的样品和使用较高的转速。有些梯度离心(如以Percoll为介质时)要求必须用角转头，否则形成的梯度不均一，线性很差．
(3) 区带转头 为一空腔，没有离心管，样品液直接放在腔内。适用于大量样品分离。
(4) 分析转头 是分析小室，专用于分析。
转头都有一定的使用极限，在说明书里可以查到。所以必须建立使用档案，记录使用的时间和次数，到一定时限后(根据使用说明)最高使用转速必须降低10％。若使用又达期限，可依次再降低10％转速使用。
2.超速离心管由于超速离心产生巨大的离心力，离心管不能用玻璃制作。有塑料的和不锈钢两种。下面是常用的几种材料及特性，可根据实验需要选配：
(1) CAB (cellulose acetobutyrate，醋酸丁酯纤维素) LH为0－15℃下使用，HT为20－40℃下使用。透明。可用于较稀的酸、碱、盐。但当pH=8以上，有机溶剂，重盐如CsCl时仅有限条件下可用。适用于酒精及蔗糖梯度。
(2) PC(polycarbonate，聚碳酸酯)：-150℃－121℃之间使用。半透明。对中性盐、稀酸稳定。但对有机物、酒精、油、MDSO、碱敏感。很硬，可不装满。
(3) PA(polyallomer，聚丙烯和聚乙烯的聚合物) -40－125℃下使用。半透明。化学性质最稳定，但高温易变软。
(4) PCR (polyclear，超透明) 0℃－20℃下使用。与PC相似，但比PC更硬。
(5) PE(polyethylene，聚乙烯) -180℃－90℃下使用。不透明。对丙酮、醋酸、盐酸等稳定。高温易变软，必须装满。
(6) PP(polypropyiene，聚丙烯) -180℃－145℃下使用。半透明。化学及温度性能稳定，但低温下发脆。不要在4℃以下离心。
(7) PS(polystyrol，聚苯乙烯) 透明坚硬。对大多数水溶液稳定，但不能沾许多有机物，一次性使用。多用于低速离心。
(8) PF (polyflor，聚氟) -100℃－140℃下使用，半透明。
(9) 不锈钢 能抗热，抗化学腐蚀，能高压消毒，但较重，也较贵。
3.样品的装载和平衡 由于离心时产生很大的离心力。当转头所带的样品处于不平衡状态时，会产生很大的力矩。轻者引起机器发抖和震动，重者会扭断转轴造成事故。因此离心样品的平衡装载是特别要注意的问题。
离心管至少要二二平衡，放在转头的对称位置，装管数是6、12、18的转头可3个一批平衡。最好是所有的离心管一样重。水平转头不允许有空挡，即不挂吊篮的现象，否则会损坏转头。
离心转速越高，对平衡的要求也越高。如超速离心机不仅要求在对称位置的离心管一样重，吊篮一样重，而且吊篮还有编号，需对号放置。但有种小型台式离心机
(也称之Eppendorf离心机，样品用0.5-1.5ml的塑料尖底离心管装载。)由于转轴较软，有一定调节能力，允许仅用目测平衡。除此外所有离心
机均要求用天平平衡样品。
在平衡时不仅要保证静平衡，即对称的两管样品等重，还要保证动平衡。因为离心时产生的力矩不仅与样品的重量有关，还和样品的旋转半径有关。例如一管水和半
管砂子虽然重量相等，但半管砂子的旋转半径要大一些，所以力矩相差很大，转动起来并不平衡。所以处于对称位置的两个离心管必须装载密度相近的样品。例如要
同时离心两个样品，一管是用蒸馏水稀释的，另一管是用60%的蔗糖配制的。虽然两管重量相等，但不可配成一对离心，而必须另装一管水和一管60%的蔗糖作
为平衡物分别配重，否则不能正常运转。
在超速离心时为了减小阻力，都是在真空状态下运行。所以除了不锈钢和厚壁聚碳酸脂
(PC)离心管外，样品必须装满，否则离心管会因真空而变形或破裂。因此吊篮盖也要盖紧，不然样品会挥发和浓缩。
(四)离心机的选购与管理 离心机的型号、种类繁多，价格比较贵，选购时应根据工作多方衡量。通常应从下边几个因素考虑：
（1）离心的目的，分析离心还是制备离心；
（2）样品的种类和数量，是细胞、病毒，还是蛋白，样品量的大小。根据这些因素决定购买分析离心机还是制备离心机；是低速、高速还是超速；是大容量、常量的还是微量的离心机。
(3) 经济能力：当机型确定后就应考虑生产厂家及价格，价格和产品的性能是同步的。
(4) 其他细节：如离心操作是否简便，维修是否方便，设计是否已过时，易损件供应是否方便等问题。
(5)
配套问题：一台离心机不可能同时在低速，高速和超速条件下运行。一般讲超速离心机只限于超速离心，不宜于做高速离心更不宜于做低速离心，同样高速离心机也
不宜于低速离心。因此买超速离心机要考虑配备高速离心机，否则发挥不了优势。一般说低速、高速的使用频率较高，而超速离心机的利用率较低，超速离心机仅经
常使用的实验室购置或考虑地区性的公用设置。
离心机的型号确定后，就是选购什么样的离心转头。考虑的最主要的根据就是样品的容量及离心的条件。通常有水平转头和角转头各一个，或大容量(相对较低速)
的转头和小容量高转速的转头各一个即可满足工作中的不同需要，不可追求越全越好，因为离心转头种类很多，许多是相似的，而超速机的转头价格相当昂贵，如果
全部配齐其价格要比离心机主机高出好几倍，也没有必要。由于转头转速的不同价格相差很大。从转速上讲不宜追求越高越好，但应有离心机允许的最高转速的转
头，否则对离心机而言是个浪费。有两台离心机的单位可考虑转头型号互补以节省经费。
离心机的管理，从国内多年离心机的使用情况看，各类型离心机应由专人负责管理和维护。高、超速离心机要求定期检查维修，使用者应详细记录实验状态及维修情
况，以保证离心机的安全使用。高、低速离心机由于操作简单，通过阅读说明书，训练操作后可以自己使用。而超速离心机结构复杂，工作程序也较繁琐，使用不当
易发生事故，特别对离心转头更应谨慎保养、使用。从国内多年使用、管理情况来看，专人保管、操作是仪器处于良好状态的保证。对管理、操作人员应进行培训，
使他们不但熟悉操作，而且对仪器也应有所了解。
(五)
大型离心机的安装 高速、超速离心机是一种精密的大型仪器，包括机械结构、电子控制系统、冷却、真空系统等部件。安装得正确与否，关系到能否达到技术指
标，同时也会影响仪器的使用寿命。所以，买到仪器后。首先应满足仪器的电源、水源、环境等条件。因此，在安装调试前，必须仔细阅读仪器的安装、使用说明
书。对它的性能、规格、特点、操作步骤及特殊要求都应有详细的了解，然后再全面地考虑安装步骤，确保达到仪器的技术指标。
首先按着装箱单逐件查对、清点零件、配件，并仔细观察各零件、配件有无碰撞损坏。如数清点，再将仪器放置在所要放的位置。
离心机的体积大，重量重，特别是超速离心机。一般在500 kg以上，最重可达800kg。因此在搬运的过程中要小心谨慎，倾斜度不宜过大，不要超过30度。避免碰撞冲击，以防止零件脱落损坏或以生其它事故。
1. 条件要求
(1)
对实验室的要求 离心机工作于高、超速运转状态，因而一定要安放在坚固、平稳的地面上。仪器本身的重量在600-800kg左右，如搁置在二楼，单位面积
的载重负荷一定要满足仪器要求（150
kg/m2）。实验室要有良好的通风设备，以便散发热量。湿度一般要求低于70％，避免不应有的潮湿生锈、绝缘破坏及真空度的降低。另外，安装位置应考虑
操作、维修的方便以及空气的流通，所以仪器的后方和侧面距离墙壁至少应有30-50cm，前方（正面）与墙壁间至少应有10-15 cm空间。
(2)对电源的要求 大型离心机的功率较大，为了安全应有自己的供电线路和独立的闸刀开关。电压的波动范围也应满足仪器要求。仪器外壳要接一外加地线，有条件可专做地线。
2.整机安装调试 拆掉离心机四周面板，去掉在搬运前安放的固定件。检查各控制线路板，继电器及接触器各引线、真空及制冷冻的管道接头是否有松脱断线情
况。安装水冷管、电源线。如有需要按说明书装润滑油和真空泵油（扩散泵油一般厂家出厂时已装好）。如用内部冷却装置的离心机应装好冷却液到规定的指标。按
要求用水平仪放在驱动主轴上或离心转头水平面上，调整底脚螺丝以调整整机水平，然后用螺母固紧。按照说明书的要求对驱动系统进行调整。调好后，整机固牢；
然后进行试运行。取最高转速的角转头和所用试管，装满溶液，平衡后放入离心孔，将转头安放到主轴上。然后按着操作程序一步一步地进行试运转。
当仪器的水、油、真空度均满足运转条件时，选择控制温度、极限温度后即可升速，这时应分段慢慢加速。在低转速时观察驱动系统的运转状态。有无振动，碳刷打火花，电流过大等异常现象。再一步一步地升到最高转速。在运转平稳后，校对温度、温度控制及速度的平稳。
3. 应注意的几个问题
(1) 未装离心转头时不能启动运转；空试管不能放入离心头孔中做试验。
(2)离心转头要轻轻地放到驱动轴上。对有销钉的转轴，离心头要放入销钉内正确位置。VAC系列的离心机，驱动轴下端扁头，要放入从动齿轮（小钢齿轮）扁槽里。如没有放入，当电机运转时会形成“飞车”。
(3) 试验样品的比重如大于1.2时，采用不锈钢试管或管帽时，转头最高转速应降低。
(4) 不可盲目调整真空、油、水压力开关及其电位器。
(六)超速离心机的离心方法 用离心方法分离生物大分子和亚细胞物质的基本原理是根据它们在液体介质中或者沉降速度不同而形成不同的区带，或者它们的密度
不同而停留在液体介质中不同的位置而把它们一一分开。前者是沉降速度法，应用该法时液体介质的最大密度要小于样品中最小颗粒的密度，离心时选用高转速和短
时间；后者是沉降平衡法，应用该法时液体介质的最大密度要大于样品中最小颗粒的密度，离心时选用较低转速和较长时间。实际操作有几种形式：
1.差速离心 这种方法是选择不同转速的离心，分别分离各个不同组分。例如先用低速沉降大颗粒和上清液，在高速离心上清沉降中等颗粒，最后超速离心上清沉降小颗粒。采用逐级提高离心力分离上情液的方法，把不同大小的颗粒分开。
这种方法比较简单，方便。分离的组份沉到管底，因此可以迅速浓缩所要的组份，减少体积。但回收率和纯度是有矛盾的，要提高回收率，势必提高转速或延长离心时间，这样大小相近的颗粒也会沉到管底。因此该法多用于粗提纯或初步浓缩样品。
2.
速度区带(或速度梯度)离心 本法是将样品放在一个连续的密度梯度液体上，通过离心，大颗粒沉降快，小颗粒沉降慢。经过一段时间，相同的颗粒就在同一深度
形成一条带子，因此把各种组份分开来。它适用于分离密度相同、而大小不同的物质，如不同的蛋白质组份密度都差不多，但分子量不一样，用本法很容易将其分
开。但对密度不同、大小类似的物质则不易分离。
蔗糖梯度是一种常用的介质。用不同浓度的蔗糖溶液(5%-60%)配成梯度，用于梯度离心。再分别进行收集处于不同区带里的各个组份。
3.沉降平衡离心 这是静力学的方法。在离心管中形成一个液体梯度，在离心时各组份以不同的速度下沉，但最终停留在与自己相同的密度中，形成一条狭窄的平
衡带，并保持相对的稳定。为了使样品所有组份都能达到它们的平衡位置，需要长时间离心。这种方法适用于分离大小相似但密度不同的物质，如核酸的分离。氯化
铯梯度是常用于平衡离心的介质，分辨率很高，可区别密度相差0.05的组分，但离心时间需十几到几十小时，且价格很贵。现在已有一种商品名叫”
Percoll”的聚蔗糖溶液可以代替氯化铯梯度。该介质能迅速形成梯度，使离心时间大大缩短到1-2h而仍有很好的分离效果。并且有配套的标记珠
（Density marker beads）可以测定样品的密度。
图4-2说明了速度区带离心和沉降平衡离心的关系：空心圆圈表示密度较小的颗粒，实心圆圈表示密度较大的颗粒。开始离心时大颗粒（无论是密度较大还是较小
的）都很快沉降下来，而小颗粒滞后。这样可把大小颗粒分开。这就是速度区带分离。当离心时间延长到足够长后，颗粒均达到与自己密度相同的平衡位置而不再移
动。同一密度的颗粒停在同一位置（无论颗粒的大小）。这就是沉降平衡分离。所以我们看出：
前者需要高转速短时间，而后者需要长时间离心，速度相对并不很重要。
图4-2 速度区带离心和沉降平衡离心的示意图
ρ1 较轻微粒的浮密度
ρ2 较重微粒的浮密度
离心条件的选择：
速度：颗粒小用较高速度，颗粒大则用较低速度。有的物体如细胞，有囊膜的病毒，转速太高会变形或失活，要较低转速和较长时间。
温度：温度低些样品不易失活。但并非越低越好。温度太低盐易析出或结晶，无法离心。温度太低蔗糖溶液粘度迅速增加，形成很大的阻力。使沉降过程变得很难进行离心管也会发脆，样品也容易成团，影响区带的形成。常用的离心温度是10-15℃。
梯度离心后收集各组分的方法见图4-3。
(1)直接吸取 用长针头注射器直接吸取所需该法适用于只有一、二条带的情况。当形成的带子很多，或者带子很弱，或要对整个梯度进行分析时不适用。
2)顶替法 把很稠很重的介质(如60％－70％)的蔗糖液慢慢注入离心管底部，将离心管中的溶液顶替出来。
(3)穿刺法 先用一块胶布贴在离心管底部，再用针头刺穿离心管的底部，使液体顺针头逐滴流出，再分部收集。
(4) 虹吸法 用一根很细的管插到离心管的底部，将溶液导出分段接收，要注意防止已分开的区带被扰乱。
图4-3 密度梯度离心后收集各组分的方法
A. 通过一针管将密的液体泵到梯度的底部，然后将一专门的盖帽导出。
B. 可穿刺离心管底，使梯度滴出，将一具有合适阀门的盖帽放到离心管顶可控制替换的速度。
C.可在离心管顶装一盖帽，泵入空气或轻的液体，通过插到离心管底部的针管将梯度替换出。
离心后转头和离心管的处理：离心结束后，离心管可用有机碘，新洁尔灭，过氧乙酸等消毒，有些管可以高压灭菌（如PP，PC，PF见前节介绍离心管特性）。
转头可用清水洗净，禁止用热水（会退火，影响强度），腐蚀剂和硬刷子（破坏保护层，失去平衡精度）。尽快擦干放好，严禁碰撞。
