动物源性食品中四环素、沙星类
残留量的快速测定方法
范围
本方法规定了动物源性食品中四环素类、沙星类高效液相色谱的快速测定方法。
本方法适用于动物源性食品中四环素类、沙星类高效液相色谱的快速测定。
2.1 原理
试样中的残留物经四环素类、沙星类快速检测前处理试剂盒处理，样液经四环素类专用层析柱净化、浓缩用高效液相色谱检测，外标法定量。
2.2 试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。
2.2.1 乙腈：色谱纯。
2.2.2 甲醇：色谱纯。
2.2.3 三乙胺（分析纯）
2.2.4 磷酸（85%）（分析纯）
2.2.5 磷酸氢二钠:优级纯。
2.2.6 乙二胺四乙酸二钠。
2.2.7 柠檬酸：分析纯。
2.2.8 磷酸氢二钠溶液:0.2mol/L。称取28.41g磷酸氢二钠,用水水溶解,定容至1000mL。
2.2.9 柠檬酸酸溶液:0.1mol/L。称取21.01g柠檬酸,用水溶解,定溶至1000mL。
2.2.10 Mcllvaine缓冲溶液:将1000mL0.1mol/L柠檬酸溶液与625mL0.1mol/L磷酸氢二钠溶液混合。
2.2.11 Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液:0.1mol/L。称取60.5g乙二胺四乙酸二钠放入1625mLMclllvaine缓冲溶液中,使其溶解,摇匀。
2.2.12 标准品: 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星纯度大于98 %。
2.2.13 标准贮备溶液:分别称取土霉素、四环素、金霉素、强力霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星各10mg，用甲醇溶解并定溶于100 mL棕色容量瓶中，配制成100 µg/mL的标准贮备液，置于-20℃保存，有效期三个月。
2.2.14 混合标准工作溶液:用流动相稀释标准贮备溶液，配制成土霉素、四环素、金霉素、强力霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星均为10 µg/mL的混合标准溶液。0～4℃避光保存。
2.2.15 四环素、沙星类快速检测前处理试剂盒* ()。
2.3 仪器和设备
2.3.1 高效液相色谱仪：配紫外-可见光波长检测器。
2.3.2 匀浆机。
2.3.3 固相萃取机
2.3.4 离心机：4000 r/min。
2.3.5 调速多用振荡器。
2.3.6 聚四氟乙烯离心管: 2.5 mL，50 mL，具塞。
2.4 样品制备
准确称取已捣碎的样品5.00 g于50 mL离心管中,先加入四环素、沙星类快速检测前处理试剂盒中的提取剂1*(液体20mL)，用调速多用振荡器150 rpm振荡3 min,，4000 r/min离心5 min，收集上清液；再加入提取剂2*(液体10ml) 用调速多用振荡器150 rpm振荡3 min,4000 r/min离心5 min，合并上清液；取一半上清液加入四环素专用层析柱中(使用前依次用5mL甲醇、5mL缓冲液（2.2.11）激活)挤干，用0.80mL甲醇洗脱,收集洗脱液,用0.2mL乙酸铵缓冲液至1.0mL。供仪器测定。
2.5 测定
2.5.1 液相色谱条件
a) 色谱柱: C18柱，250 mm×4 mm(i.d.),粒度5µm;
b) 流动相: 0.05 mol/L磷酸/三乙胺缓冲液（pH2.4）+乙腈(80+20,V/V);
c) 流速: 1.0mL/min;
d) 柱温: 室温;
e) 检测波长: 四环素类紫外检测器360 nm。沙星类 紫外检测器310nm；荧光检测器激发波长280nm，发射波长450nm。
f) 进样量：50 uL。
3.5.2 标准工作曲线绘制
移取各移取四环素类、沙星类混和标准液，用流动相稀释成20 ng/mL、50 ng/mL、250 ng/mL、500 ng/mL标准工作溶液。按液相色谱条件（3.5.1）进行测定，以色谱峰的峰面积为纵坐标，与其对应的浓度为横坐标作图，绘制标准工作曲线，标准工作曲线范围：20.0~500 ng/mL。
3.5.3 试样测定
用微量进样器准确吸取试样溶液（3.4），按液相色谱条件（3.5.1）进行测定，记录色谱峰的保留时间和峰面积。
3.6 结果计算
按式（1）分别计算供试样品中的四环素类、沙星类残留量。
2×ci×V
ω= …… (1)
m
ω－水产品中四环素、沙星类残留量，μg/kg；
ci －标准曲线上查出试样溶液中四环素、沙星类标准工作溶液的浓度，（μg/L）；
V－最终定容体积数，mL；
2－换算常数；
m－供试试料样品重量，g。
本方法分别计算四环素类、沙星类结果。
3.7 检测限
本方法土霉素、四环素检测限为20µg/kg；金霉素、强力霉素的检测限为50µg/kg，沙星类为：5µg/kg
3.8 回收率
本方法土霉素、四环素、金霉素、强力霉素回收率为:75%～85%；沙星类回收率为：75%～85% |
