大肠菌群的测定方法 [复制链接]

GB/T 4789.10—1994

食品卫生微生物学检验　金黄色葡萄球菌检验

　　1　主题内容与适用范围 　　本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌的检验方法。 　　本标准适用于食品和食物中毒样品中金黄色葡萄球菌的检验。 　　2　引用标准 　　GB 4789.28　食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 　　3　设备和材料 　　3.1　显微镜。 　　3.2　温箱：36±1℃。 　　3.3　离心机。 　　3.4　灭菌吸管：1mL、10mL。 　　3.5　灭菌试管。 　　3.6　灭菌平皿。 　　3.7　均质器。 　　3.8　载玻片。 　　3.9　L型涂布棒。 　　3.10　酒精灯。 　　3.11　接种环。 　　4　培养基和试剂 　　4.1　胰酪陈大豆肉汤：按GB 4789.28中4.59规定。 　　4.2　7.5%氯化钠肉汤：按GB 4789.28中4.61规定。 　　4.3　血琼脂平板：按GB 4789.28中4.6规定。 　　4.4　Baird－Prker琼脂平板：按GB 4789.28中4.60规定。 　　4.5　肉浸液肉汤：按GB 4789.28中4.1规定。 　　4.6　灭菌盐水。 　　4.7　兔血浆：按GB 4789.28中4.63规定。 　　5　检验程序 　　金黄色葡萄球菌检验程序如下： 　　（图略） 　　6　操作步骤 　　6.1　增菌培养法 　　6.1.1　检样处理 　　称取25g固体样品；吸取25mL液体样品，加入225mL灭菌生理盐水，固体样品研磨或置均质器中制成混悬液。 　　6.1.2　增菌及分离培养 　　吸取5mL上述混悬液，接种于7.5%氯化钠肉汤或胰酪陈大豆肉汤50mL培养基内，置36±1℃温箱培养24h，转种血平板和Baird－Parker平板，36±1℃培养24h，挑取金黄色葡萄球菌菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。 　　6.1.3　形态 　　本菌为革兰氏阳性球菌，排列是葡萄球状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌菌体较小，直径约为0.5～1μm。 　　6.1.4　在肉汤中呈混浊生长，在胰酪陈大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长，血平板上菌落呈金黄色，也有时为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。在Baird－Parker平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。 　　6.1.5　血浆凝固酶试验 　　吸取1∶4新鲜兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0.5mL，振荡摇匀，放36±1℃温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。 　　6.2　直接计数方法 　　6.2.1　吸取上述1：10混悬液，进行十倍递次稀释，根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液1mL，分别加入三块Baird－Parker平板，每个平板接种量分别为0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用灭菌L棒涂布整个平板。如水分不多吸收，可将平板放在36±1℃温箱1h，等水分蒸发后反转平皿置36±1℃温箱培养。 　　6.2.2　在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落，并从中任选5个菌落，分别接种血平板，36±1℃24h培养后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养法。 　　6.2.3　菌落计数：将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除以5，再乘以稀释倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数。 　　 　　　　　　　　　　　　

GB/T 4789.30—1994

　单核细胞增生李斯特氏菌检验

　　1　主题内容与适用范围 　　本标准规定了单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法。 　　本标准适用于食品和食物中毒样品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。 　　2　引用标准 　　GB 4789.28　食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 　　3　设备和材料 　　3.1　温箱30℃和25C。 　　3.2　天平。 　　3.3　500mL三角瓶。 　　3.4　接种环。 　　3.5　接种针。 　　3.6　载玻片。 　　3.7　盖玻片。 　　3.8　显微镜或相差显微镜。 　　3.9　平皿。 　　3.10　试管。 　　3.11　均质器。 　　3.12　无菌注射器。 　　3.13　吸管：1mL，10mL。 　　3.14　单核细胞增生李斯特氏菌标准株。 　　3.15　马红球菌。 　　4　培养基和试剂 　　4.1　含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆肉汤(TSB－YE)：见附录A1。 　　4.2　含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆琼脂(TSA－YE)：见附录A2。 　　4.3　EB增菌液：见附录A3。 　　4.4　LB增菌液(LB₁，LB₂)：见附录A4。 　　4.5　三糖铁(TSI)琼脂：GB 4789.28中4.26，4.27。 　　4.6　SIM动力培养基：见附录A5。 　　4.7　血琼脂：GB 4789.28中4.6。 　　4.8　改良的Mc Bride(MMA)琼脂：见附录A5。 　　4.9　硝酸盐培养基：GB 4789.28中3.17。 　　4.10　缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR和VP试验用)：GB 4789.28中3.4。 　　4.11　糖发酵培养基：GB 4789.28中3.2。 　　4.12　过氧化氢酶试验：GB 4789.28中4.38。 　　4.13　盐酸吖啶黄(AcriflavineHCl)(Sigma)。 　　4.14　萘啶酮酸钠盐(Naladixicacid)(Sigma)。 　　5　检验程序 　　单核细胞增生李斯特氏菌检验程序如下： 　　（略） 　　6　操作步骤 　　6.1　样品的收集及处理 　　无菌采取样品25g(mL)放灭菌均质器中加225mLEB和LB增菌液中，充分搅拌成均质。如不能及时检验，可暂存4℃冰箱。 　　6.2　增菌培养 　　EB增菌液放30±1℃培养48h～7d，LB₁增菌液225mL放30±1℃，培养24h，取出0.1mL，加入10mL LB₂增菌液中二次增菌。 　　6.3　分离培养 　　将EB增菌液和LB₂二次增菌液分离于选择培养基MMA琼脂平板上，培养30±1℃48h，挑选可疑菌落，用白炽灯45°角斜光照射平板，李斯特氏菌的菌落为灰蓝或蓝色，小的圆形的菌落。 　　6.4　选5个以上的上述可疑菌落接种三糖铁(TSI)琼脂和SIM动力培养基，培养于25±1℃，观察是否有动力，且成伞状或月芽状生长。一般观察2～7d，阳性者可做下一步鉴定。 　　6.5　纯培养 　　将上述有动力、形成伞状者并在三糖铁琼脂培基上层、下层的产酸而不产硫化氢的可疑培养物接种于胰酪胨大豆琼脂培养基(TSA－YE)上，做纯培养供做以下鉴定。 　　6.6　染色镜检 　　将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片检查；李斯特氏菌为革兰氏阳性小杆菌，大小为0.4～0.5μm×0.5～2.0μm；用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。 　　6.7　生化特性 　　将上述可疑菌做进一步的生化试验，单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特性及有关菌的区别见表1。 　　表1单核细胞增生李斯特氏菌生化性状与有关菌的区别 　　（表略） 　　6.8　对小鼠的致病力试验 　　将符合上述特性的纯培养物接种于TSB－YE中，在30℃培养24h，离心，浓缩，使浓缩液每毫升10¹⁰/mL个细菌，取0.5mL浓缩菌液注射小白鼠腹腔，3～5只，观察小鼠死亡情况。致病株于2～5d内死亡。试验时可用已知菌作对照。单核细胞增生李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌对小鼠有致病性。 　　6.9　协同溶血试验(cAMP) 　　在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红球菌(R.equi)，在它们中间垂直接种可疑李斯特氏菌，但不要触及它们，在30℃培养24～48h，检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。靠近金黄色葡萄球菌接种点的单核细胞增生李斯特菌的溶血增强，西尔李斯特氏菌的溶血也增强，而绵羊李斯特氏菌在马红球菌附近的溶血增强，有助于鉴别。 　　 　　　　　　　　　　　　　　　　附录A 　　　　　　　　　　　　　　　 培养基 　　　　　　　　　　　　　　　(补充件) 　　A1　含0.6%酵母漫膏的胰酪胨大豆肉汤(TSB－YE) 　　A1.1　成分 　　胰胨　　　　　　　　　　　17g 　　多价胨　　　　　　　　　　3g 　　酵母膏　　　　　　　　　　6g 　　氯化钠　　　　　　　　　　5g 　　磷酸氢二钾　　　　　　　　2.5g 　　葡萄糖　　　　　　　　　　2.5g 　　蒸馏水　　　　　　　　　　1000mL 　　A1.2　制法 　　将上述各成分加热搅拌溶解，调至pH7.2～7.4，分装，121℃灭菌15min，备用。 　　A2　含0.6%酵母膏胰酪胨大豆琼脂(TSA－YE) 　　A2.1　成分 　　胰胨　　　　　　　　　　　17g 　　多价胨　　　　　　　　　　3g 　　酵母膏　　　　　　　　　　6g 　　氯化钠　　　　　　　　　　5g 　　磷酸氢二钾　　　　　　　　2.5g 　　葡萄糖　　　　　　　　　　2.5g 　　琼脂　　　　　　　　　　　15g 　　蒸馏水　　　　　　　　　　1000mL 　　A2.2　制法 　　将上述各成分加热搅拌溶解，调pH至7.2～7.4，分装，121℃高压灭菌,备用。 　　A3　EB增菌液 　　A3.1　成分 　　胰胨　　　　　　　　　　　17g 　　多价胨　　　　　　　　　　3g 　　酵母膏　　　　　　　　　　6g 　　氯化钠　　　　　　　　　　5g 　　磷酸氢二钾　　　　　　　　2.5g 　　葡萄糖　　　　　　　　　　2.5g 　　蒸馏水　　　　　　　　　　1000mL 　　盐酸吖啶黄　　　　　　　　15mg/L 　　萘啶酮酸　　　　　　　　　40mg/L 　　A3.2　制法 　　除吖啶黄和萘啶酮酸外，其余成分加热混合调pH至7.2～7.4，121℃15min高压灭菌。使用前加吖啶黄溶液15mg/L和萘啶酮酸溶液40mg/L，此两种成分要无菌配制或过滤除菌。 　　A4　李氏增菌肉汤(LB₁，LB₂) 　　A4.1 成分 　　胰胨　　　　　　　　　　　5g 　　多价胨　　　　　　　　　　5g 　　酵母膏　　　　　　　　　　5g 　　氯化钠　　　　　　　　　　5g 　　磷酸二氢钾　　　　　　　　1.35g 　　磷酸氢二钠　　　　　　　　12g 　　七叶苷　　　　　　　　　　1g 　　蒸馏水　　　　　　　　　　1000mL 　　A4.2　制法 　　将上述成分加热溶解，调pH至7.2～7.4，分装，121℃15min高压灭菌。 　　A4.2.1　李氏I液(LB₁)225mL中加入： 　　1%萘啶酮酸(用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制)　　 0.45mL 　　1%吖啶黄(用灭菌蒸馏水配制)　　　　　　　　　0.27mL 　　A4.2.2　李氏Ⅱ液(LB₂)200mL中加入： 　　1%萘啶酮酸　　　 0.40mL 　　1%吖啶黄　　　　 0.50mL 　　无菌分装于10mL大试管中。 　　A5　改良的Mc Bride琼脂(MMA) 　　A5.1　成分 　　胰胨　　　　　　　　　　　5g 　　多价胨　　　　　　　　　　5g 　　牛肉膏　　　　　　　　　　3g 　　葡萄糖　　　　　　　　　　1g 　　氯化钠　　　　　　　　　　5g 　　磷酸氢二钠　　　　　　　　1g 　　苯乙醇　　　　　　　　　　2.5mL 　　无水甘氨酸　　　　　　　　10g 　　氯化锂　　　　　　　　　　0.5g 　　琼脂　　　　　　　　　　　15g 　　蒸馏水　　　　　　　　　　1000mL 　　A5.2　制法 　　将上述成分加热搅拌混匀，调pH至7.2～7.4，分装，121℃ 15min高压灭菌，备用。 　　A6　SIM动力培养基 　　A6.1　成分 　　胰胨　　　　　　　　　　　20g 　　多价胨　　　　　　　　　　6g　　 　　硫酸铁铵　　　　　　　　　0.2g 　　硫代硫酸钠　　　　　　　　0.2g 　　琼脂　　　　　　　　　　　3.5g 　　蒸馏水　　　　　　　　　　1000mL 　　A6.2　制法 　　将上述各成分加热混匀，调pH7.2，分装小试管，高压灭菌121℃ 15min。

GB/T 4789.15—1994

食品卫生微生物学检验　霉菌和酵母计数

　　1　主题内容与适用范围 　　本标准规定了各类粮食、食品和饮料霉菌和酵母菌计数的检验方法。 　　本标准适用于各类粮食、食品和饮料中霉菌和酵母菌的计数。 　　2　引用标准 　　GB 4789.28　食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 　　3　设备和材料 　　3.1　温箱：25～28℃。 　　3.2　振荡器。 　　3.3　天平。 　　3.4　显微镜。 　　3.5　玻塞三角瓶：300mL。 　　3.6　试管：15mm×150mm。 　　3.7　平皿：直径9cm。 　　3.8　吸管：1mL及10mL。 　　3.9　酒精灯。 　　3.10　载物玻片。 　　3.11　盖玻片。 　　3.12　广口瓶。 　　3.13　牛皮纸袋：121℃灭菌20min。 　　3.14　金属勺、刀等。 　　3.15　试管架。 　　3.16　接种针。 　　3.17　橡皮乳头。 　　4　培养基和试剂 　　4.1　马铃薯－葡萄糖琼脂培养基，附加抗菌素，按GB 4789.28中4.79规定。 　　4.2　孟加拉红培养基：按GB 4789.28中4.81规定。 　　4.3　高盐察氏培养基：按GB 4789.28中4.78规定。 　　4.4　灭菌蒸馏水。 　　4.5　乙醇。 　　5　检验程序 　　检验程序如下： 　　（图略） 　　6　操作步骤 　　6.1　采样：取样时须特别注意样品的代表性和避免采样时的污染。首先准备好灭菌容器和采样工具，如灭菌牛皮纸袋或广口瓶，金属刀或勺等。在卫生学调查基础上，采取有代表性的样品。样品采集后应尽快检验，否则应将样品放在低温干燥处。 　　粮食(包括粮库贮粮，粮店或家庭小量存粮)样品的采集，可根据粮囤或粮垛的大小和类型，分层定点取样，一般可分三层五点，或分层随机采取不同点的样品，充分混合后，取500g左右送检。小量存粮可使用金属小勺采取上、中、下各部位的混合样品。 　　海运进口粮的采样：每一船仓采取表层、上层、中层及下层四个样品，每层从五点取样混合，如船仓盛粮超过10000t，则应加采一个样品。必要时采取有疑问的样品送检。 　　谷物加工制品(包括熟饭、糕点、面包等)、发酵食品、乳及乳制品以及其他液体食品，用灭菌工具采集可疑霉变食品250g，装入灭菌容器内送检。 　　6.2　以无菌操作称取检样25g(或25mL)，放人含有225mL灭菌水的玻塞三角瓶中，振摇30min，即为1：10稀释液。 　　6.3　用灭菌吸管吸取1∶10稀释液10mL，注入试管中，另用带橡皮乳头的1mL灭菌吸管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。 　　6.4　取1mL1∶10稀释液注入含有9mL灭菌水的试管中，另换一支1mL灭菌吸管吹吸5次，此液为1∶100稀释液。 　　6.5　按上述操作顺序做10倍递增稀释液，每稀释一次，换用一支1mL灭菌吸管，根据对样品污染情况的估计，选择3个合适的稀释度，分别在做10倍稀释的同时，吸取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做2个平皿，然后将凉至45℃左右的培养基注入平皿中，待琼脂凝固后，倒置于25～28℃温箱中，3d后开始观察，共培养观察5d。 　　6.6　计算方法：通常选择菌落数在10～150之间的平皿进行计数，同稀释度的2个平皿的菌落平均数乘以稀释倍数，即为每克(或毫升)检样中所含霉菌和酵母数。 　　6.7　报告：每克(或毫升)食品所含霉菌和酵母数以个/g(个/mL)表示。 　　 　　　　　　　　　　　　霉菌直接镜检计数法 　　　　　　　　　　　　　　 　　常用的为郝氏霉菌计测法，本方法适用于番茄酱罐头。 　　A1　设备和材料 　　A1.1　烧杯。 　　A1.2　玻璃棒。 　　A1.3　折光仪。 　　A1.4　显微镜。 　　A1.5　郝氏计测玻片：是一特制的、具有标准计测室的玻片。 　　A1.6　盖玻片。 　　A1.7　测微器：具标准刻度的玻片。 　　A2　操作步骤 　　A2.1　检样的制备：取定量检样，加蒸馏水稀释至折光指数为1.3447～1.3460(即浓度为7.9%～8.8%)，备用。 　　A2.2　显微镜标准视野的校正：将显微镜按放大率90～125倍调节标准视野，使其直径为1.382mm。 　　A2.3　涂片：洗净郝氏计测玻片，将制好的标准液，用玻璃棒均匀的摊布于计测室，以备观察。 　　A2.4　观测：将制好之载玻片放于显微镜标准视野下进行霉菌观测，一般每一检样应观察50个视野，最好同一检样两人进行观察。 　　A2.5　结果与计算：在标准视野下，发现有霉菌菌丝其长度超过标准视野(1.382mm)的1/6或三根菌丝总长度超过标准视野的1/6(即测微器的一格)时即为阳性(＋)，否则为阴性(－)，按100个视野计，其中发现有霉菌菌丝体存在的视野数，即为霉菌的视野百分数。

GB/T 4789.4—1994

食品卫生微生物学检验　沙门氏菌检验

　　1　主题内容与适用范围 　　本标准规定了食品中沙门氏菌的检验方法。 　　本标准适用于食品和食物中毒样品中沙门氏菌的检验。 　　2　引用标准 　　GB 4789.28　食品卫生微生物学检验　染色法、培养基和试剂 　　3　设备和材料 　　3.1　天平：称取检样用。 　　3.2　均质器或乳钵。 　　3.3　温箱：36±1℃，42℃。 　　3.4　显微镜。 　　3.5　灭菌广口瓶：500mL。 　　3.6　灭菌三角烧瓶：500mL，250mL。 　　3.7　灭菌吸管：10mL。 　　3.8　天菌平皿：90mm×15mm。 　　3.9　灭菌小试管：内径3mm，长5cm。 　　3.10　灭菌毛细管。 　　3.11　橡皮乳头。　　 　　3.12　载玻片。 　　3.13　酒精灯。　　 　　3.14　灭菌金属匙或玻璃棒。 　　3.15　接种棒、镍铬丝。 　　3.16　试管架、试管篓。 　　4　培养基和试剂 　　4.1　缓冲蛋白胨水(BP)：按GB 4789.28中4.12规定。 　　4.2　氯化镁孔雀绿(MM)增菌液：按GB 4789.28中4.13规定。 　　4.3　四硫酸钠煌绿(TTB)增菌液：按GB 4789.28中4.14、4.15规定。 　　4.4　亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液：按GB 4789.28中4.16规定。 　　4.5　亚硫酸铋琼脂(BS)：按GB 4789.28中4.19规定。 　　4.6　DHL琼脂：按GB 4789.28中4.20规定。 　　4.7　HE琼脂：按GB 4789.28中4.21规定。 　　4.8　WS琼脂：按GB 4789.28中4.23规定。 　　4.9　SS琼脂：按GB 4789.28中4.22规定。 　　4.10　三糖铁琼脂：按GB 4789.28中4.26，4.27规定。 　　4.11　蛋白胨水、靛基质试剂：按GB 4789.28中3.13规定。 　　4.12　尿素琼脂(pH7.2)：按GB 4789.28中3.15规定。 　　4.13　氰化钾(KCN)培养基：按GB 4789.28中3.16规定。 　　4.14　氨基酸脱羧酶试验培养基：按GB 4789.28中3.12规定。 　　4.15　糖发酵管：按GB 4789.28中3.2规定。 　　4.16　ONPG培养基：按GB 4789.28中3.3规定。 　　4.17　半固体琼脂：按GB 4789.28中4.30规定。 　　4.18　丙二酸钠培养基：按GB 4789.28中3.7规定。 　　4.19　沙门氏菌因子血清：按26种用于初步分型；57种用于进一步分型；163种用于详细分型。 　　5　检验程序 　　沙门氏菌检验程序如下： 　　（图略） 　　6　操作步骤 　　6.1　前增菌和增菌 　　冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。各称取检样25g，加在装有225mL缓冲蛋白陈水的500mL广口瓶内。固体食品可先应用均质器以8000～10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化，于36±1℃培养4h(干蛋品培养18～24h)，移取10mL，转种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫酸钠煌绿增菌液内，于42℃培养18～24h。同时，另取10mL，转种于100mL亚硒酸盐肮氨酸增菌液内，于36±1℃培养18～24h。 　　鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。各取25g(25mL)加入灭菌生理盐水25mL，按前法做成检样匀液；取25mL，接种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42℃培养24h；另取25mL接种于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36±1℃培养18～24h。 　　6.2　分离 　　取增菌液1环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板和一个DHL琼脂平板(或HE琼脂平板、WS或SS琼脂平板)。两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。于36±1℃分别培养18～24h(DHL、HE、WS、SS)或40～48h(BS)，观察各个平板上生长的菌落，沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和沙门氏菌Ⅲ在各个平板上的菌落特征见表1。 　　表1　沙门氏菌属各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征 　　（图略） 　　6.3　生化试验 　　6.3.1　自选择性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂。在三糖铁琼脂内，肠杆菌科常见属种的反应结果见表2。 　　表2　肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果 　　（图略） 　　续表2 　　（图略） 　　表2说明在三糖铁琼脂内只有斜面产酸并同时硫化氢(H₂S)阴性的菌株可以排除，其他的反应结果均有沙门氏菌的可能，同时也均有不是沙门氏菌的可能。 　　6.3.2　在接种三糖铁琼脂的同时，再接种蛋白陈水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基和赖氨酸脱竣酶试验培养基及对照培养基各1管，于36±1℃培养18～24h，必要时可延长至48h，按表3判定结果。按反应序号分类，沙门氏菌属的结果应属于A1、A2和B1，其他5种反应结果均可以排除。 　　表3　肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表 　　（图略） 　　6.3.2.1　反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸3项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常，则按A3判定为弗劳地氏柠檬酸杆菌。 　　表4 　　（图略） 　　注：＋表示阳性；－表示阴性。 　　6.3.2.2　反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，按表5判定结果。 　　表5 　　（图略） 　　6.3.2.3　反应序号B1：补做ONPG。ONPG十为大肠埃希氏菌，ONPG－为沙门氏菌。同时，沙门氏菌应为赖氨酸＋，但甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸－。 　　6.3.2.4　必要时按表6进行沙门氏菌生化群的鉴别。 　　表6 沙门氏菌属各生化群的鉴别 　　（图略） 　　6.4　血清学分型鉴定 　　6.4.1　抗原的准备 　　一般采用1.5%琼脂斜面培养物作为玻片凝集试验用的抗原。 　　O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的(如2.5%一3%)培养基上再检查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时，将菌株接种在0.7%～0.8%半固体琼脂平板的中央，候菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.3%～0.4%半固体琼脂的小玻管1～2次，自远端取菌培养后再检查。 　　6.4.2　O抗原的鉴定 　　用A～F多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。 　　被A～F多价O血清凝集者，依次用O4；O3、10；O7；O8；O9；O2和O11因子血清做凝集试验。根据试验结果，判定O群。被O3、10血清凝集的菌株，再用O10、O15、O34、O19单因子血清做凝集试验，判定E1、E2、E3、E4各亚群，每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果，没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。 　　不被A～F多价O血清凝集者，先用57种或163种沙门氏菌因子血清中的9种多价O血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的O群血清逐一检查，以确定O群。每种多价O血清所包括的O因子如下： 　　O 多价 1　 A，B，C，D，E，F群(并包括6，14群) 　　O 多价 2　 13，16，17，18，21群 　　O 多价 3　 28，30，35，38，39群 　　O 多价 4　40，41，42，43群 　　O 多价 5　44，45，47，48群 　　O 多价 6　50，51，52，53群 　　O 多价 7　55，56，57，58群 　　O 多价 8　59，60，61，62群 　　O 多价 9　63，65，66，67群 　　6.4.3　H抗原的鉴定 　　属于A～F各O群的常见菌型，依次用表7所述H因子血清检查第1相和第2相的H抗原。 　　表7 A～F群常见菌型H抗原表 　　（图略） 　　不常见的菌型，先用163种沙门氏菌因子血清中的8种多价H血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种血清所包括的各种H因子血清逐一检查，以确定第1相和第2相的H抗原。8种多价H血清所包括的H因子如下： 　　H 多价 1　a，b，c，d，i 　　H 多价 2　eh，enx，enz₁₅，fg，gms，gpu，gp，gq，mt，gz₅₁ 　　H 多价 3　k，r，y，z，z₁₀，lv，lw，lz₁₃，lz₂₈，lz₄₀ 　　H 多价 4　1，2；1，5；1，6；1，7；z₆ 　　H 多价 5　z₄z₂₃，z₄z₂₄，z₄z₃₂，z₂₉，z₃₅，z₃₆，z₃₈ 　　H 多价　6 z₃₉，z₄₁，z₄₂，z₄₄ 　　H 多价　7 z₅₂，z₅₃，z₅₄，z₅₅ 　　H 多价　8 z₅₆，z₅₇，z₆₀，z₆₁，z₆₂ 　　每一个H抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的检查结果，没有H单因子血清的要用两个H复合因子血清进行核对。 　　检出第1相H抗原而未检出第2相H抗原的或检出第2相H抗原而未检出第1相H抗原的，可在琼脂斜面上移种1～2代后再检查。如仍只检出一个相的H抗原，要用位相变异的方法检查其另一个相。单相菌不必做位相变异检查。 　　位相变异试验方法如下： 　　小玻管法：将半固体管(每管约1～2mL)在酒精灯上溶化并冷至50℃，取已知相的H因子血清0.05一0.1mL，加入于溶化的半固体内，混匀后，用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻管内，候凝固后，用接种针挑取待检菌，接种于一端。将小玻管平放在平皿内，并在其旁放一团湿棉花，以防琼脂中水分蒸发而干缩，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可以从另一端挑取细菌进行检查。培养基内血清的浓度应有适当的比例，过高时细菌不能生长，过低时同一相细菌的动力不能抑制。一般按原血清1∶200～1∶800的量加入。 　　小倒管法：将两端开口的小玻管(下端开口要留一个缺口，不要平齐)放在半固体管内，小玻管的上端应高出于培养基的表面，灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热溶化，冷至50℃，挑取因子血清1环，加入小套管中中的半固体内，略加搅动，使其混匀，俟凝固后，将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可从套管外的半固体表面取菌检查，或转种1%软琼脂斜面，于37℃培养后再做凝集试验。 　　简易平板法：将0.7%～0.8%半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取因子血清1环，滴在半固体平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央点种待检菌株，培养后，在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。 　　6.4.4　Vi抗原的鉴定 　　用Vi因子血清检查。已知具有Vi抗原的菌型有：伤寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌，都柏林沙门氏菌。 　　6.5　菌型的判定和结果报告 　　综合以上生化试验和血清学分型鉴定的结果，按照表8或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型，并报告结果。

GB/T 4789.13—1994

食品卫生微生物学检验　产气荚膜梭菌检验

　　1　主题内容与适用范围 　　本标准规定了产气荚膜梭菌的检验方法。 　　本标准适用于食品和食物中毒样品中产气荚膜梭菌的检验。 　　2　引用标准 　　GB 4789.28　食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 　　3　设备和材料 　　3.1　均质器。 　　3.2　显微镜。 　　3.3　温箱：36±1℃。 　　3.4　水浴。 　　3.5　厌氧培养装置：常温催化除氧式或碱性焦性没石子酸除氧式。 　　3.6　吸管：1mL，10mL。 　　3.7　试管。 　　3.8　平皿。 　　3.9　接种环或接种针。 　　4　培养基和试剂 　　4.1　庖肉培养基：GB 4789.28中4.67。 　　4.2　亚硫酸盐－多粘菌素－磺胺嘧啶琼脂(SPS)：GB 4789.28中4.69。 　　4.3　液体硫乙醇酸盐培养基(FT)：GB 4789.28中4.70。 　　4.4　动力－硝酸盐培养基：GB 4789.28中4.72。 　　4.5　含铁牛奶培养基：GB 4789.28中4.71。 　　4.6　卵黄琼脂培养基：GB 4789.28中4.68。 　　4.7　0.1%蛋白胨水稀释剂：GB 4789.28中4.86。 　　4.8　硝酸盐还原试剂：GB 4789.28中3.17。 　　4.9　革兰氏染色液：GB 4789.28中2.2。 　　5　检验程序 　　产气荚膜梭菌检验程序如下： 　　（图略） 　　6　操作步骤 　　6.1　活菌计数培养 　　6.1.1　按无菌操作称取食品检样25g(mL)放入均质器，加0.1%蛋白陈水稀释剂225mL，低速搅动1～2min，使之均质化，作为1∶10稀释液。 　　6.1.2　以上述1∶10稀释的均质液按1mL加0.1%蛋白陈稀释剂9mL做成10^-2～10^-6的系列稀释液。 　　6.1.3　吸取各稀释液1mL分别放入2个灭菌平皿内。每个平皿浇注约50℃的SPS琼脂15～20mL，仔细转动平皿，使稀释液和琼脂充分混匀。 　　6.1.4　上述琼脂平板凝固后，倒置于厌氧培养装置内，于36±1℃培养24h。 　　6.1.5　选取长有30～300个黑色菌落的平板，计数黑色菌落数。 　　6.2　确证试验 　　6.2.1　由平板上任取10个黑色菌落，分别按种FT培养基，于36±1℃培养18～24h。 　　6.2.2　用上述培养液涂片，革兰氏染色镜检。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗大杆菌，其耐热株可能形成卵形芽孢，位于菌体中央或近端，其宽度一般不大于菌体。 　　6.2.3　用接种环(针)穿刺接种动力－硝酸盐培养基，于36±1℃培养24h，观察接种线的生长情况，判断有无动力。然后，滴加甲萘胺液和对氨基苯磺酸液各0.5mL，观察硝酸盐是否被还原。产气荚膜梭菌无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。 　　6.2.4　取生长旺盛的FT培养液1mL接种于含铁牛乳培养基，在46℃水浴中培养2h后观察有无“暴烈发酵”现象，5h内不发酵者为阴性。产气荚膜梭菌发酵乳糖，凝固酪蛋白并大量产气，呈“暴烈发酵”现象，但培养基不变黑。 　　6.2.5　用接种环取FT培养液点种于卵黄琼脂平板(每张平板至少可接种10点)，于36±1℃厌氧培养24h，观察接种点的变化。产气荚膜梭菌产生卵磷脂酶，分解卵黄中的卵磷脂，接种点的底部及周围形成乳白色的混浊带。 　　6.3　菌数计算 　　根据黑色菌落的计数(6.1.5)和确证试验的结果(6.2)，计算每克(毫升)食品检样的含菌数。　　 　　例如：10^-4稀释液的平板长有黑色菌落100个，而供做确证试验的10个菌落中有7个被确证为产气荚膜梭菌，则每克(毫升)食品检样所含产气荚膜梭菌数为： 　　100×0.7×10⁴＝7×10⁵

GB/T 4789.6—1994

　致泻大肠埃希氏菌检验

　　1　主题内容与适用范围 　　本标准规定了食品中致泻大肠埃希氏菌的检验方法。 　　本标准适用于食品和食物中毒样品中致泻大肠埃希氏菌的检验。 　　2　引用标准 　　GB 4789.28 食品卫生微生物学检验　染色法、培养基和试剂 　　3　设备和材料 　　3.1　天平：称取检样用。 　　3.2　均质器或乳钵。 　　3.3　温箱：36±1℃，42℃。 　　3.4　水浴：100℃，65～68℃，50℃。 　　3.5　显微镜。 　　3.6　离心机。 　　3.7　酶标仪。 　　3.8　细菌浓度比浊管：Mac Farland3号。 　　3.9　灭菌广口瓶：500mL。 　　3.10　灭菌三角烧瓶：500mL，250mL。 　　3.11　灭菌平皿：90mm×15mm。 　　3.12　灭菌试管：10mm×75mm。 　　3.13　灭菌吸管：1mL，5mL。 　　3.14　橡皮乳头。 　　3.15　载玻片。 　　3.16　酒精灯。 　　3.17　灭菌金属匙或玻璃棒。 　　3.18　接种棒，镍铬丝。 　　3.19　试管架，试管篓。 　　3.20　冰箱。 　　3.21　注射器：0.25mL，连接内径为1mm塑料小管一段。 　　3.22　灭菌的刀子、剪子、镊子。 　　3.23　小白鼠：1～4日龄。 　　3.24　硝酸纤维素滤膜150mm×50mm，φ.45μm。临用时切成两张，每张75mm×50mm，用铅笔划格，每格6mm×6mm，每行10格，分6行。灭菌备用。 　　4　培养基和试剂 　　4.1　乳糖胆盐发酵管：按GB 4789.28中4.9规定。 　　4.2　营养肉汤：按GB 4789.28中4.8规定。 　　4.3　肠道菌增菌肉汤：按GB 4789.28中4.18规定。 　　4.4　麦康凯琼脂：按GB 4789.28中4.24规定。 　　4.5　伊红美蓝琼脂(EMB)：按GB 4789.28中4.25规定。 　　4.6　三糖铁琼脂(TSI)：按GB 4789.28中4.26，4.27规定。 　　4.7　克氏双糖铁琼脂(KI)：按GB 4789.28中4.28，4.29规定。 　　4.8　糖发酵管(乳糖、鼠李糖、木糖和甘露醇)：按GB 4789.28中3.2规定。 　　4.9　赖氨酸脱羧酶试验培养基：按GB 4789.28中3.12规定。 　　4.10　尿素琼脂(pH7.2)：按GB 4789.28中3.15规定。 　　4.11　氰化钾(KCN)培养基：按GB 4789.28中3.16规定。 　　4.12　蛋白陈水、靛基质试剂：按GB 4789.28中3.13规定。 　　4.13　半固体琼脂：按GB 4789.28中4.30规定。 　　4.14　HOnda氏产毒肉汤：按GB 4789.28中4.34规定。 　　4.15　Elek氏培养基：按GB 4789.28中4.35规定。 　　4.16　氧化酶试剂：按GB 4789.28中3.18规定。 　　4.17　革兰氏染色液：按GB 4789.28中2.2规定。 　　4.18　致病性大肠埃希氏菌诊断血清、侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清、产肠毒素大肠埃希氏菌诊断血清、出血性大肠埃希氏菌诊断血清。 　　4.19　产肠毒素大肠埃希氏菌LT和ST酶标诊断试剂盒。 　　4.20　产肠毒素LT和ST大肠埃希菌标准菌株。 　　4.21　抗LT抗毒素。 　　4.22　多粘菌素B纸片：300IU，φ16mm。 　　4.23　0.1%硫柳汞溶液。 　　4.24　2%伊文思蓝溶液。 　　5　检验程序 　　致泻大肠埃希氏菌检验程序如下： 　　（图略） 　　6　操作步骤 　　6.1　增菌 　　样品采集后应尽快检验。除了易腐食品在检验之前应预冷藏外，一般不冷藏。以无菌手续称取检验25g，加在225mL营养肉汤中，以均质器打碎1min或用乳钵加灭菌砂磨碎。取出适量，接种乳糖胆盐培养基，以测定大肠菌群MPN，其余的移入500mL广口瓶内，于36±1℃培养6h。挑取1环，接种于1管30mL肠道菌增菌肉汤内，于42℃培养18h。 　　6.2　分离 　　将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平板；污染严重的检样，可将检样匀液直接划线接种麦康凯或伊红美蓝平板，于36±1℃培养18～24h，观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。 　　6.3　生化试验 　　6.3.1　自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁琼脂(TSI)或克氏双糖铁琼脂(KI)。同时将这些培养物分别接种蛋白胨水、半固体、pH7.2尿素琼脂、KCN肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。以上培养物均在36℃培养过夜。 　　6.3.2　TSI斜面产酸或不产酸，底层产酸，H₂S阴性，KCN阴性和尿素阴性的培养物为大肠埃希氏菌。TSI底层不产酸，或H₂S、KCN、尿素有任一项为阳性的培养物，均非大肠埃希氏菌。必要时做氧化酶试验和革兰氏染色。 　　6.4　血清学试验 　　6.4.1　假定试验：挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌的琼脂培养物，用致病性大肠埃希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价O血清和出血性大肠埃希氏菌O157血清做玻片凝集试验。当与某一种多价O血清凝集时，再与该多价血清所包含的单价O血清做试验。致泻大肠埃希氏菌所包括的O抗原群见表1。如与某一个单价O血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性。 　　表1 致泻大肠埃希氏菌所包括的O抗原群 　　（图略） 　　6.4.2　证实试验：制备O抗原悬液，稀释至与Mac Farland3号比浊管相当的浓度。原效价为1：160～1：320的O血清，用0.5%盐水稀释至1：40。稀释血清与抗原悬液在10mm×75mm试管内等量混合，做单管凝集试验。混匀后放于50℃水浴箱内，经16h后观察结果。如出现凝集，可证实为该O抗原。 　　6.5　肠毒素试验 　　6.5.1　酶联免疫吸附试验检测LT和ST。 　　6.5.1.1　产毒培养：将试验菌株和阳性及阴性对照菌株分别接种于0.6mLCAYE培养基内，37℃振荡培养过夜。加入20000IU/mL的多粘菌素B0.05mL，于37℃ 1h，离心4000r/min 15min，分离上清液，加入0.1%硫柳汞0.05mL，于4℃保存待用。 　　6.5.1.2　LT检测方法(双抗体夹心法)：(1)包被：先在产肠毒素大肠埃希氏菌LT和ST酶标诊断试剂盒中取出包被用LT抗体管，加入包被液0.5mL，混匀后全部吸出于3.6mL包被液中混匀，以每孔100μL量加入到40孔聚苯乙烯硬反应板中，第一孔留空作对照，于4℃冰箱湿盒中过夜。(2)洗板：将板中溶液甩去，用洗涤液I洗3次，甩尽液体，翻转反应板，在吸水纸上拍打，去尽孔中残留液体。(3)封闭：每孔加100μL封闭液，于37℃水浴中1h。(4)洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。(5)加样本：每孔分别加各冲试验菌株产毒培养液100μL，37℃水浴中1h。(6)洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。(7)加酶标抗体：先在酶标LT抗体管中加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于3.6mL稀释液中混匀，每孔加100μL，37℃水浴中1h。(8)洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。(9)酶底物反应：每孔(包括第一孔)各加基质液100μL，室温下避光作用5～10min，加入终止液50μL。(10)结果判定：以酶标仪在波长492nm下测定吸光度OD值，待测标本OD值大于阴性对照3倍以上为阳性，目测颜色为桔黄色或明显高于阴性对照为阳性。 　　6.5.1.3　ST检测方法(抗原竞争法)：(1)包被：先在包被用ST抗原管中加0.5mL包被液，混匀后全部吸出于1.6mL包被液中混匀，以每孔50μL加入于40孔聚苯乙烯软反应板中。加液后轻轻敲板，使液体布满孔底。第一孔留空作对照，置4℃冰箱湿盒中过夜。(2)洗板：用洗涤液I洗3次，操作同上。(3)封闭：每孔，加100μL封闭液，37℃水浴1h。(4)洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。(5)加样本及ST单克隆抗体：每孔分别加各试验菌株产毒培养液50μL，稀释的ST单克隆抗体50μL(先在ST单克隆抗体管中加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于1.6mL稀释液中，混匀备用)，37℃水浴1h。(6)洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。(7)加酶标记兔抗鼠Ig复合物：先在酶标记兔抗鼠Ig复合物管中加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于3.6mL稀释液中混匀，每孔加100μL，37℃水浴1h。(8)洗板：用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。(9)酶底物反应：每孔(包括第一孔)各加基质液100μL，室温下避光5～10min，再加入终止液50μL。(10)结果判定：以酶标仪在波长492nm下测定吸光度(OD)值： 　　（图略） 　　目测无色或明显淡于阴性对照为阳性。 　　6.5.2　双向琼脂扩散试验检测LT：将被检菌株按五点环形接种于Elek氏培养基上。以同样操作，共做两份，于36℃培养48h。在每株菌的菌苔上放多粘菌素B纸片，于36℃经5～6h，使肠毒素渗入琼脂中，在五点环形菌苔各5mm处的中央，挖一个直径4mm的圆孔，并用一滴琼脂垫底。在平板的中央孔内滴加LT抗毒素30μL，用已知产LT和不产毒菌株作对照，于36℃经15～20h观察结果。在菌斑和抗毒素孔之间出现白色沉淀带者为阳性，无沉淀带者为阴性。 　　6.5.3　乳鼠罐胃试验检测ST 　　将被检菌株接种于Honda氏产毒肉汤内，于36℃培养24h，以3000r/min离心30min，取上清液经薄膜滤器过滤，加热60℃30min，每1mL滤液内加入2%伊文思蓝溶液0.02mL。将此滤液用塑料小管注入1～4日龄的乳鼠胃内0.1mL，同时接种3～4只，禁食3～4h后用三氯甲烷麻醉，取出全部肠管，称量肠管(包括积液)重量及剩余体重。肠管重量与剩余体重之比大于0.09为阳性，0.07～0.09为可疑。 　　6.6　结果报告 　　综合以上生化试验、血清学试验、肠毒素试验作出报告。

以上标准已经有最新版标准GB4789-2003。

如何才能找到2003年的最新标准，希望赐教！谢谢！

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