[分享][公告]准确测定和表征β-葡聚糖酶活的方法与比较(百特纯大... [复制链接]

准确测定和表征β-葡聚糖酶活的方法与比较

1. β-葡聚糖酶的应用及作用机理

β-葡聚糖作为植物细胞壁的结构性非淀粉多糖，广泛存在于燕麦、大麦、黑麦、小麦等麦类作物中。如图1 所示，常见麦类作物中，燕麦和大麦β-葡聚糖含量较高，其中燕麦含量最高(Choct M and Annison G., 1990)。在饲料、啤酒等行业中，由于β-葡聚糖是限制麦类有效利用的主要因素，常使用β-葡聚糖酶来有效分解麦类植物胚乳细胞壁中的β－葡聚糖，以降低饲料中非淀粉多糖（Non-Starch Polysaccharide, NSP）及其抗营养因子的含量；降低啤酒酿造中麦汁黏度，提高麦芽溶出率，稳定啤酒质量。

图1 常见麦类作物中β-葡聚糖含量

β-葡聚糖酶是具有β-(1→3)、(1→4)糖苷酶活性的专一性内切酶。图2示出β-葡聚糖的基本结构以及酶切作用的机理。其中，每个实心圆表示一个葡萄糖分子，实心圆之间连线表示糖苷键，箭头所示为酶切位点。从图中可以看到，葡萄糖分子之间通过β-(1→4)糖苷键形成结构单体(monomer)：包括纤维三糖(cello-trisaccharide)、纤维四糖(cello-tetrasaccharide)和极少量的低聚糖(cello-oligosaccharide)，同时结构单体之间通过β-(1→3)糖苷键连接从而形成β-葡聚糖线性结构。当β-葡聚糖酶作用于β-葡聚糖的β-(1→3)、β- (1→4)糖苷键时，可使糖苷键断裂，将其降解成寡糖和单糖。

图2 β-葡聚糖分子结构图和酶切位点示意图

2. 测定β-葡聚糖酶活性的标准方法

    β－葡聚糖酶活的测定方法主要有3种，即还原糖测定法（分光光度法）、粘度测定法和底物染色法。其中还原糖测定法（分光光度法）简便实用，比较准确，而且测定的结果重复性好，对于β－葡聚糖酶活的测定，一般认为是其3种方法中的首选方法；粘度测定法虽然更接近酶和底物在动物体内的作用方式，但这种方法目前仅能进行半定量描述，而且测定时比较繁琐费时；底物染色法是一种新型的方法，它是通过对底物的人工着色，然后测定颜色的变化来计算酶活，但这种方法难以操作，目前还没有得到广泛应用（王在贵等，2002）。

    目前国内外采用较多的还是还原糖测定法（分光光度法），其原理是：β-葡聚糖酶能将β-葡聚糖降解成寡糖和单糖，具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。由于反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中β－葡聚糖酶的活力成正比，因此，可以通过分光比色测定反应液颜色的强度，从而计算反应液中β－葡聚糖酶的活力（农业部标准，NY/T 911-2004）。