高效液相色谱法检测黄曲霉毒素M1操作规程
作为国内专业从事霉菌毒素检测技术与产品服务的主要供应商之一， 近年来应用实验室重点关注食品安全事件尤其是涉及霉菌毒素安全等检测技术问题，以期望快速提出解决方案。针对近期奶中出现的黄曲霉毒素M1超标问题，提出以下快速解决方案。
1. 仪器
1.1 高效液相色谱仪配荧光检测器
1.2 震荡器（或高速搅拌器）
1.3 高速离心机
2. 试剂与试液
2.1 色谱甲醇
2.2 蒸馏水
2.3 乙腈+水（25+75）
2.4 石油醚
2.5 10%乙腈
2.6 氢氧化钠溶液（0.5mol/L）
玻璃纤维滤纸（PriboFast免疫亲和柱免费赠送）
3. 测定法
本法系用高效液相色谱法（GB/T 18980-2003）测定牛奶，奶粉等产品中的黄曲霉毒素M1，除另有规定外，按下列方法测定。
3.1 色谱条件
色谱柱：C18柱，150×4.6mm，5um
检测器：荧光检测器；激发波长365nm，发射波长435nm；
流动相：乙腈-水（25：75）
流 速：1.0ml/min
进样量：20ul
柱 温：室温
3.2 标准品溶液的配制
取黄曲霉毒素M1标准品，用乙腈稀释成0.5ug/ml的标准储备液。根据使用需要，准确吸取10μl、20μl、50μl、100μl、200μl的黄曲霉毒素标准储备液，置5ml的容量瓶中，用流动相稀释至刻度，配成相当于1ng/ml、2g/ml、5ng/ml、10g/ml、20ng/ml的标准工作液，即得。
3.3 样品前处理
3.3.1牛奶
将100mL牛奶水浴加热至40℃；
4000r/min离心15min，收集50mL清澈液待用；
3.3.2乳粉和粉状婴幼儿配方食品
称取10g奶粉样品，将100mL50℃水多次少量加入，搅拌，使奶粉充分溶解；
6000r/min离心15min，收集50mL清澈液待用；
3.3.3发酵乳(包括固体状、半固体状和带果肉型)
称取60 g混匀的试样，用0.5 mol/L 的氢氧化钠溶液在酸度计指示下调pH至7.4；
用高速均质器在 9500 转/分钟，高速匀浆5 min
水浴加热至40℃；
4000r/min离心15min，收集50mL清澈液待用
3.3.4干酪
称取经切细、过10目圆孔筛混匀的试样5g置于50 mL离心管中，加2 mL水和30 mL甲醇；
用高速均质器在 9500r/分钟，高速匀浆5 min；
超声提取30 min；
在6000r/分钟下离心15 min，收集上清液并移入250 mL分液漏斗中。
在分液漏斗中加入30 mL石油醚，振摇2 min；
待分层后，将下层移于50 mL烧杯中，弃去石油醚层。
重复用石油醚提取2次；。
将下层溶液移到100 mL圆底烧瓶中，减压浓缩至约2 mL；
浓缩液倒入离心管中，烧瓶用乙腈-水溶液(1+4) 5 mL分2次洗涤，洗涤液一并倒入50 mL离心管中；
加水稀释至约50 mL，在6000 转/分钟下离心 5 min，上清液供净化处理。
3.3.5奶油
称取5g试样，置于50 mL烧杯中；
用20 mL石油醚将其溶解并移于250mL具塞锥形瓶中。
加20 mL水和30 mL甲醇，振荡30 min后，将全部液体移于分液漏斗中；
待分层后，将下层溶液全部移到100 mL圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪中减压浓缩至约5 mL，加水稀释至约50mL，供净化处理。
3.4 供试品溶液的制备
3.4.1 PriboFast® 黄曲霉毒素M1免疫亲和柱的操作
将免疫亲和柱连接于50.0mL玻璃注射器下。准确移取50.0mL净化溶液注入玻璃注射器；
将空气压力泵与注射器连接，调节压力使溶液以约2-3mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2～3mL空气通过柱体；
更换10ml注射器与亲和柱连接，在注射器中加入10ml水，调节压力使水以约6mL/min流速清洗亲和柱。
准确加入4mL色谱级乙腈洗脱，流速为1 mL/min～2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。（建议将乙腈的量分2-4次加入。每次加入后，要让甲醇充分浸泡柱子里的凝胶2分钟。洗脱后的乙腈溶液，最好是水浴30℃加热吹近干。用10%乙腈定容后上液相）
3.5 测定
精密量取1ng/ml、2g/ml、5ng/ml、10g/ml、20ng/ml的标准工作液各20ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。另精密量取供试品溶液20ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素M1的量，计算，即得。
1.本实验应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境。
2.残留有黄曲霉毒素M1的废液或废渣的玻璃器皿，应置于专用贮存容器（装有10%氯酸钠溶液）内，浸泡24小时以上，再用清水将玻璃器皿冲洗干净。
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