二、大肠菌群MPN的常规检验方法
大肠菌群MPN常规的检验方法有三管系列、五管系列和其它系列,其原理相同,区别在于样品滴度和各滴度的管数,三管系列接种三个滴度、每个滴度三管、五管系列接种五个滴度、每个滴度五管。以三管系列较为简便。
我国现有两个大肠菌群检测标准,一个是国家标准(GB4789.3-84),另一个是专业标准(ZBX09002-86)。
大肠菌群MPN的常规检验方法是将不同倍数的检样稀释液接种到乳糖胆盐发酵管内,经一定的温度、时间发酵,若均不产气者则可报告为阴性;如有产气者,则需进行分离培养,证实试验,然后查取MPN检索表,报告出每100nll(g)大肠菌群的最近似数。大肠菌群MPN的检验程序如下:
(一)检样稀释:
(1)以无菌操作将检样25ml(或25g)放于含有225ml灭菌生理盐水或其它稀释液的
灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨作成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用匀质器。以8000-10000转/分钟的速度处理1分钟,做成 1:10的均匀稀释液。
(2)用1ml灭菌吸管吸取1:10稀轻液1m1.注入含有9ml灭菌生理盐水或其它稀释液的试管内,振摇试管混匀.作1:10的稀释液。
(3)另取1m1灭菌吸管,按上项操作依次作10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用 1支1m1灭菌吸管:
(4)根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度接 种3管。
(二)乳糖发酵试验
在乳糖发酵试验工作中,经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡(有时比小米粒还小),有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明,大肠菌群的产气量,多者可以使发酵倒管全部充满气体,少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时,可以用手轻轻打动试管,如有气泡沿管壁上浮,即应考虑可能有气体产生,而应作进一步试验。
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1ml以上者,用双料乳糖胆盐发酵管;1m1及1m1以下者,用单料乳糖胆盐发酵管,每一稀释度接种3管,置36+1℃温箱内,培养24+2小时,如所有乳糖胆盐发酵管均不产气,则可报告为大肠菌群阴性。如有产气者,按下列程序进行。
(三)分离培养
将产气的发酵管分别转种到伊红美兰琼脂平板上,置36±1℃温箱内培养18—24小 时,然后取出,观察菌落形态,并作革兰氏染色和证实试验。