开堂食品卫生检验课 [复制链接]

蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)食物中毒，是一种常见的食物中毒。第一起蜡样芽胞杆菌食物中毒的完整报告在1950年发表于挪威，随后许多国家，特别是北欧和东欧国家也报告有类似的食物中毒爆发。1971年以来英国也报告过多起蜡样芽胞杆菌食物中毒。我国于1973年南京市卫生防疫站，1974年鞍山市卫生防疫站相继报告蜡样芽胞杆菌食物中毒以来，近几年来又有一些单位报告了本菌引起的食物中毒。引起食物中毒的食品范围很广，包括肉类、菜汤、烧鸡、炒菜、鱼、牛奶、点心食品，剩饭等等。

蜡样芽胞杆菌分布比较广泛，在土壤和植物上及许多食物上都能分离到。引起食物中毒的食品必须含有较大量的细菌，每克或每毫升食品中约需含107个以上的蜡样芽胞杆菌。

蜡样芽胞杆菌在食品上，于20度以上的环境中放置，能迅速繁殖并产生肠毒素，同时，由于本菌不分解蛋白质，因此，食品在感官上无明显变化，无异味，很容易误食而发生中毒。

一、生物学特性

1．形态和染色特性

本菌为革兰氏阳性的大杆菌，菌体两端较平整，芽胞呈椭圆形，位于菌体中央稍偏一端，芽胞较菌体小。

2．培养特性

1）需氧菌，生长温度范围在10C一45℃之间。最适生长温度为28—35℃。

2）对营养要求不高，在普通培养基上生长良好。本菌在普通琼脂平板上，生长的菌落呈乳白色，不透明，边缘不整齐，直径为4—6mm，菌落边缘往往呈扩散状，表面稍干燥。

3）在血液琼脂平板上形成浅灰色、不透明、似毛玻璃状的菌落。在菌落周围初呈草绿色溶血，时间稍长即完全透明。

4）在普通肉汤内生长迅速，肉汤混浊，常常有菌膜或壁环，振摇易乳化。

3．生化特性

4．血清学特性

蜡样芽胞杆菌有两种抗原，一种是耐热的，一种是不耐热的。

5．抵抗力

蜡样芽胞杆菌生长型不耐热，100度 20分钟即可被杀死，对酸碱不敏感。pH6—11对本菌基本上不受影响，pH5以下，生长可受到抑制。．

“平酸”菌是一种能使某些罐头酸败而又能形成芽孢的厌氧菌。它们发酵碳水化合物的特点是能产生使食品变酸的低碳脂肪酸，但是不产生气体，也不足以改变罐头两端平面的形状，这类罐头食品的酸败被称为平盖酸败。这类菌习惯上称“平酸”菌。

常见的种类有嗜热脂肪芽胞杆菌，是一种专性嗜热菌；凝结芽胞杆菌，是一种兼性嗜热菌，其耐酸性强，是肉类，蔬菜罐头(番茄汁；番茄浆罐头等)、炼乳、奶油等腐败变质的常见菌。它们引起腐败的罐头，外观正常、不膨胀，其内容物却在平酸菌作用下呈现轻重不同的酸败状态，pH值可降低0．3—0．5。

平酸菌在自然界分布很广泛。炼乳的酸败和随后凝乳的形成常常是凝结芽胞杆菌引起的：嗜热脂肪芽孢杆菌的芽胞具有很强的抗热性，能杀死肉毒梭状芽胞杆菌的杀菌温度并不能杀死嗜热脂肪芽孢杆菌，因此在一般高温杀菌后的罐头食品中，还会有嗜热脂肪芽胞杆菌存在。

一、生物学特性

1．形态及染色特性

嗜热脂肪芽胞杆菌和凝结芽孢杆菌都为革兰氏阳性菌，具有周身鞭毛，能运动

2.培养特性

嗜热脂肪芽胞杆菌的最低生长温度为28℃，最适生长温度为50－65℃，最高生长温度为70℃～77C，在pH6.8－7.2的培养基中生长良好，当pH值接近5时就不能生长。因此，这种菌只能在pH5以上的罐头食品中生长。

凝结芽胞杆菌的最低生长温度为18C，最适生长温度为55－60℃。最高温度为55℃－60℃，能适应较高的酸度，能在pH值4.5以下的酸性罐头食品种生长，所以又称本菌为嗜热酸性芽胞杆菌。

凝结芽胞杆菌在葡萄糖胰胨琼脂培养基表面生长的菌落呈圆形，不透明，淡黄色。生长在培养基深层的菌落带有绒毛状边缘，呈浅黄色至橙色。由于酸的形成菌落周围出现一个黄色晕圈。

嗜热脂肪芽孢杆菌在葡萄糖胰胨琼脂培养基上生长，但只形成针头大小的菌落，通常显示褐色。

3．生化特性

“平酸”菌是一种能使某些罐头酸败而又能形成芽孢的厌氧菌。它们发酵碳水化合物的特点是能产生使食品变酸的低碳脂肪酸，但是不产生气体，也不足以改变罐头两端平面的形状，这类罐头食品的酸败被称为平盖酸败。这类菌习惯上称“平酸”菌。

常见的种类有嗜热脂肪芽胞杆菌，是一种专性嗜热菌；凝结芽胞杆菌，是一种兼性嗜热菌，其耐酸性强，是肉类，蔬菜罐头(番茄汁；番茄浆罐头等)、炼乳、奶油等腐败变质的常见菌。它们引起腐败的罐头，外观正常、不膨胀，其内容物却在平酸菌作用下呈现轻重不同的酸败状态，pH值可降低0．3—0．5。

平酸菌在自然界分布很广泛。炼乳的酸败和随后凝乳的形成常常是凝结芽胞杆菌引起的：嗜热脂肪芽孢杆菌的芽胞具有很强的抗热性，能杀死肉毒梭状芽胞杆菌的杀菌温度并不能杀死嗜热脂肪芽孢杆菌，因此在一般高温杀菌后的罐头食品中，还会有嗜热脂肪芽胞杆菌存在。

一、生物学特性

1．形态及染色特性

嗜热脂肪芽胞杆菌和凝结芽孢杆菌都为革兰氏阳性菌，具有周身鞭毛，能运动

2.培养特性

嗜热脂肪芽胞杆菌的最低生长温度为28℃，最适生长温度为50－65℃，最高生长温度为70℃～77C，在pH6.8－7.2的培养基中生长良好，当pH值接近5时就不能生长。因此，这种菌只能在pH5以上的罐头食品中生长。

凝结芽胞杆菌的最低生长温度为18C，最适生长温度为55－60℃。最高温度为55℃－60℃，能适应较高的酸度，能在pH值4.5以下的酸性罐头食品种生长，所以又称本菌为嗜热酸性芽胞杆菌。

凝结芽胞杆菌在葡萄糖胰胨琼脂培养基表面生长的菌落呈圆形，不透明，淡黄色。生长在培养基深层的菌落带有绒毛状边缘，呈浅黄色至橙色。由于酸的形成菌落周围出现一个黄色晕圈。

嗜热脂肪芽孢杆菌在葡萄糖胰胨琼脂培养基上生长，但只形成针头大小的菌落，通常显示褐色。

3．生化特性

二、检验

1．成品罐头中平酸菌的检验

罐头平酸腐败必须通过开检查或细菌分离培养等才能确定，具体方法如下：

1）检样的采取

将待检罐头预先经55C培养5—7天，然后开罐，取其内容物1ml（液体)或lg(固体)，以无菌操作接种于葡萄糖胰胨琼脂培养基中，每罐接种2支。未培养的作对照。

2）增菌培养

将接种的上述试管于，55℃培养48小时然后观察．若指示剂由紫变黄即为阳性，同时进行涂片镜检(有时不易检到芽胞)。

3）分离培养

将阳性试管划线接种于葡萄糖胰胨琼脂培养基上，于55度培养48小时后检查有无可疑菌落(菌落黄色，周围有黄色环，中心色深不透明)。如有可疑菌落则接种于普通琼脂斜面和芽胞培养斜面上，55℃培养24小时，涂片镜检芽孢的形态及位置，并同时以普通琼脂斜面培养物进行生化试验。

4）鉴定：

经形态和其他反应两方面鉴定。

菌体形态：取样品直接涂片镜检；平酸菌为革兰氏阳性芽胞F菩

生化反应：检查平酸腐败，可将培养过的样品与未培养过的正赏对照样品的pH值进行比较，通常足以显示出平酸腐败的存在。

3．注意事项

样品必须保管好，在采取样品和检验程序开始之间，不要在嗜热菌生长温度范围内存放很长时间，应在不超过约43C的地方贮存。

随机采取库存罐头食品样品，如酸败局限于货架上箱内的外层或外层的产品，则表明是局部受热的缘故，应注意通风散热。如发现酸败局限于货架上的内部箱，则表示生产中冷却不充分，产品继续处于嗜热菌生长温度范围内。

霉菌污染食品后，在适宜条件下会产生毒素。人和动物食用被污染了霉菌毒素的食品后，可产生各种危害，如急性或慢性中毒、肿瘤等。

霉菌产毒的特点：

①霉菌产毒仅限于少数的产毒霉菌。

②产毒菌株的产毒能力具有易变性。

③产毒霉菌产毒不具有一定的严格性。

④产毒霉菌产毒需要一定条件。

如花生、玉米易污染黄曲霉及其毒素，小麦、玉米易污染镰刀菌及其毒素，大米易污染青霉及毒素。

常见的霉菌有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、镰刀菌毒素和青霉菌毒素等。

黄曲霉毒素存在于霉变的花生、谷物、果仁和大米上。肝癌与黄曲霉毒素含量高有直接关系。为了防止产生黄曲霉毒素，最好将桃仁、果仁、谷物贮藏在密封和干燥的地方，不要吃发霉的食品，尤其是发霉的干果、桃仁和粮食。

主要由黄曲霉和寄生曲霉产生，其基本结构中都含有二呋喃环和双香豆素，黄曲霉毒素主要损害肝脏，表现为脂肪变性、出血、坏死及胆管上皮、纤维组织增生。同时肾脏也可受损害。
    临床表现 　　
    早期有胃部不适、腹胀、厌食、呕吐、一过性发热及黄疸等。2～3周后出现腹水、下肢水肿、脾脏增大变硬、胃肠道出血、昏迷甚至死亡。
    诊断 　　
    1. 有进食可疑黄曲霉菌污染食物史。
    2. 临床特点①潜伏期较长。②中毒表现：胃部不适、腹胀、厌食、呕吐、肠鸣音亢进、一过性发热及黄疸等。
    急救处理 　　
    1. 护肝。
    2. 对症支持治疗

一、黄曲霉菌及其毒素的种类

(一)产毒菌及其特性

1．黄曲霉菌

本菌属真菌门、半知菌亚门丛梗孢科曲霉属。本菌为需氧菌，最适温度30～33℃，相对湿度80－90％为最佳条件。花生、玉米、大米和小麦是其较好的生长基质。

2．寄生曲霉

寄生曲霉也是产生AFT的主要菌株，其特性与黄曲霉类似。我国分布较少。

3．其他

青霉、毛霉和根霉等真菌也能产生AFT，但产毒量甚微，其特性与黄曲霉类似。

(二)黄曲霉毒素的种类及对食品的污染

黄曲霉毒素（AFT）是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。

它们在紫外线照射下能产生荧光，根据荧光颜色不同，将其分为B族和G族两大类及其衍生物。AFT目前已发现20余种。

AFT主要污染粮油食品、动植物食品等；如花生、玉米，大米、小麦、豆类、坚果类、肉类、乳及乳制品、水产品等均有黄曲霉毒素污染。其中以花生和玉米污染最严重。家庭自制发酵食品也能检出黄曲霉毒素，尤其是高温高湿地区的粮油及制品种捡出率更高。

二、黄曲霉毒素的特性

1、AFT的毒性极强

远远高于氰化物、砷化物和有机农药的毒性，其中以B1毒性最大。当人摄入量大时，可发生急性中毒，出现急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。当微量持续摄人，可造成慢性中毒，生长障碍，引起纤维性病变，致使纤维组织增生。AFT的致癌力也居首位，是目前已知最强致癌物之一。

2、AFT具耐热性

一般烹调加工温度不能将其破坏，裂解温度为280℃。在水中溶解度较低，溶于油及一些有机溶剂，如氯仿和甲醇中，但不溶于乙醚、石油醚及乙烷。

3、食品中所污染的主要是黄曲霉毒素Bl，其毒性目前一般认为有三种临床特征；急性中毒、慢性中毒和致癌性：

(1)急性中毒：

它是一种剧毒物质，毒性比KCN大100倍，仅次肉毒霉素，是目前已知霉菌中毒性最强的。它的毒害作用，无论对任何动物，主要变化是肝脏，呈急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。脾脏和胰脏也有轻度的病变。

(2)慢性中毒：

长期摄入小剂量的黄曲霉毒素则造成慢性中毒。其主要变化特征为肝脏出现慢性损伤，如肝实质细胞变性、肝硬化等。出现动物生长发育迟缓，体重减轻，母畜不孕或产仔少等系列症状

(3)致癌性：

AFT是目前所知致癌性最强的化学物质

其致癌特点是：

A 致癌范围广，能诱发鱼类、禽类，各种实验动物、家畜及灵长类等多种动物的实验肿瘤；

B 致癌强度大，其致癌能力比六六六大1万倍；

C 可诱发多种癌，AFT主要诱发肝癌，还可话互胃癌、肾癌、泪腺癌、直肠癌、乳腺癌，卵巢及小肠等部位的肿瘤，还可出现畸胎。：

赭曲霉毒素在自然界中分布广泛，多为重要的贮藏菌，可寄生在食品、粮食及饲料中并产毒。

一、赭曲霉菌及其毒素的种类

1．产毒菌及产毒条件

1）产毒菌：

赭曲霉毒素(Ochratoxin，OTC)的产毒菌有：赭曲霉，硫色曲霉、蜜蜂曲霉及鲜绿青霉、普通青霉等。

2）分离培养

常用察氏培养基分离产毒菌；在谷物培养基中，以碎小麦为基质的产毒效果最好。

3）生长条件

一般产毒霉菌在25～28℃，高湿度、阴暗静置条件下培养1～2周产毒效果较好。

2．OCT的种类及对食品的污染

1）、种类：赭曲霉毒素包括A、B、C（简称OA、OB、OC)等几种衍生物，其化学结构也类似香豆素。

2）、对食品的污染

赭曲霉毒素可污染玉米、大麦、小麦，大米、荞麦、大豆花生、棉籽等各种食品原料及其制品，火腿、鱼制品以及饲料也有一定程度的污染。

在谷物上20℃－25℃、含水率高于16％时污染更严重。污染饲料中的毒素在动物的肝、肾、 脂肪中的蓄积较多，这是肉食污染的重要原因。

二、赭曲霉毒素的特性

1．理化特性

OCT是一种相当稳定的化台物，在乙醇溶液中置冰箱保存一年以上不破坏。

赭曲霉毒素微溶于水，溶于有机溶剂和稀的碳酸氢钵水溶液(如5％碳酸氢钠)中。

在紫外光下OA呈兰绿色荧光，OB呈兰色，OC呈亮绿色。

因OCT的分子量小，故无免疫原性，只有与蛋白质或多肽载体结合后，才能刺激机体产生相应抗体。

2．毒性

OCT中的OA的含量最高，且毒性最强，且主要侵害肾脏，是一种强烈的肾脏毒，当人和畜禽持续摄入含毒食物及饲料时，不仅会出现急性症状，也可形成严重的慢性中毒、致癌、致畸等。

1）急性毒性

OCT主要损害肾脏。病理变化包括肾小管萎缩，肾间质纤维化及肾小球透明样病变等。

2）慢性毒性

症状为肝脏可见实质细胞变性、透明变性、灶性坏死等，脾、淋巴结，扁桃体等组织也可观察到坏死性病变。

3）致癌性和致畸性

Broun等人用妊娠大白鼠作的实验证明有致畸性，蟹译等人用小白鼠作实验证明对肾脏有致癌性，按248～276ug／天持续投毒15周(总量为26—29mgOA)，即有肾细胞癌的发生。另外，给孕期7～12天的小白鼠腹腔注射5mg／kg体重的OA，出现胎鼠死亡率增加，胎鼠重量降低、畸形等。

三、OCT的检验

OCT酌检验方法与AFT基本相似，主要有生物学、化学和免疫学方法。

1．生物学方法

1）鸡胚试验(以OA为例)

将提取的OA用5％碳酸钠水溶液作不同倍数稀释，分别接种于5日龄的健康鸡胚气室内(或卵黄内)0．1ml，接种后每天观察鸡胚死亡情况直至21日龄。根据记录计算出LD50所需毒素量。

2）其它动物试验

用大白鼠，小白鼠。霰子，雏鸡、雏鸭等动物进行饲喂试验，均可检验OCT。

3）其它试验也可利用抑菌试验、荧光反应、斑点试验等生物学方法检验OCT。

2．免疫学方法

1）抗体的制备(以OA为例)

OA为半抗原物质，必须与大分子载体结合后才具有免疫原性。将偶合抗原透析纯化与福氏完全佐剂乳化，免疫家兔即获得OA抗体。

2）检测

由于OCT在食品中含量都较低，用一般化学和生物学检测方法，常缺乏特异性或灵敏度不高，用免疫学检测法能克服这些缺点。

Michael(1983)利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大麦中的OA。另外，还采用斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)对OA进行了检测，也获得了满意的结果。

一、镰刀菌及其毒素的种类

镰刀菌属的产毒菌主要有四种

1）第一种为禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)，此种菌一般侵染大米、麦类、玉米，产生的毒素为玉米赤霉烯酮等。

2）第二种为三线镰刀菌：本菌主要寄生于玉米和小麦上，可产生T-2毒素、玉米赤霉烯酮等；

3）第三种为梨孢镰刀菌：主要寄生于麦类和玉米上，产生T-2毒素，梨孢镰刀菌素等。

4）第四种为串珠镰刀菌：产生串珠镰刀菌素、赤霉菌素等。

由于镰刀菌侵染谷物的广泛性及严重性，以及该茵产生的毒素对人、畜健康的危害性。因此，镰刀菌及其毒素在国内外越来越引起人们的普遍重视。

二、毒素的特性

1、理化特性

玉米赤霉烯酮首先从赤霉病玉米中分离提取的，镰刀菌属的许多菌都产生本毒素，它又名F-2毒素、FES、RAL等。

T-2毒素是食品中酡一种重要的霉菌毒素，它主要由三线镰刀菌产生，梨孢镰刀菌等也可产生。

2．毒性

镰刀菌的毒素对人畜有强的毒害作用。

如玉米赤霉烯酮，随食品摄人机体后靶位点主要是生殖器官，还能通过胎盘屏障作用于胎儿，有此行激素的作用，主要可使畜、禽及啮齿类发生雌性激素亢进症。例如它可引起猪的发情综合症，对于妊娠牛和猪，可出现流产、死胎及畸胎。对锚匍鼠等也有类似的毒性。

T-2毒素随食品摄入机体后，其主要靶器官是消化道、造血系统、心脏、脾脏、子宫、淋巴结等。它能引起人食物中毒性白细胞缺乏症，内脏器官出血和骨髓造盘组织坏死，表现为恶心、腹痛、呕吐和全身无力等。

三．镰刀菌毒素的检验

l、样品的采集与处理

取样时要注意样品的代表性和避免采样时的污染。首先准备好灭菌容器和采样工具，如灭菌牛皮纸袋或广口瓶、金属刀或勺等。样品采集后应尽快检验，否则应将样品放在低温干燥处。

粮食样品采集，可根据粮囤或粮垛的大小和类型，分层定点取样，即每屠的四角和中央分别采取部分样品混和后按四分法取样，每份不少于500g。少量存粮可使用金属小勺采取上、中、下各部位的混合样品。进口粮采样应在每一车、船采取表、上、中、下层4个样品。每层从5点取样混合：必要时采取有疑问的样品送检。

粮食加工食品(如面包等)，发酵食品、乳、肉、蛋、鱼及制品用灭菌工具采集可疑霉变食品25g，装入灭菌容器内检验。

2、检样方法

(1)形态学检查与分离鉴定

①镜检

霉变饲料直接涂片镜检阳性率不高，通常用培养在察氏培养基或玻片培养物作镜检。根据大型分生孢子的弯曲度(镰刀形弯曲——新月形)，顶端细胞(宽窄形状等)以及孢子的各种星态（镰刀形、纺锤形、披针形、新月形等)进行判断。

②分离培养

将检样接种于察氏平板培养基中，每平皿接种玉米10粒，共种5个平皿。接种时，用镊子夹取玉米将胚部向下，轻轻压种于浅层，然后在22~C～28℃温箱中培养48小时，生长为茂盛的菌丝呈白色绒毛状，基质呈深肉色到红色，取菌丝做压滴标本镜检。

马铃薯培养基：生长茂盛，菌丝白。绒毛状，基质呈深绿色、黄褐色至红褐色。

米饭培养基：菌丝白色，绒毛状、生长茂盛，基质呈黄色到金黄色。

一、青霉菌及其毒素的特性

青霉菌是属于曲霉科青霉属。

种类很多，分布很广，其中讦多菌株均能引起食品的霉烂，也有不少菌株能产生强烈的毒素。

黄绿青霉、桔青霉、冰岛青霉、扩展青霉、鲜绿青霉等，它们所产生毒素的毒性作用各异。

1．桔青霉素：

是一种能杀灭革兰氏阳性菌的抗生素，因其毒性太强，未能用于治疗。

本毒素主要得之于桔青霉、黄绿毒霉、鲜绿青霉等，它是“黄变米”中的霉菌毒素之一。桔青霉素为黄色针状结晶。

主要污染大米、小麦，大麦、燕麦和黑麦等。桔青霉素对小鼠经口LD50为110mg／kg。具有肾毒性，可使肾脏肿大、肾小管扩张、变性和坏死，有致突变性。

2．冰岛青霉毒素(1slanditoxin)

由冰岛青霉产剩，是“沤黄米”或“黄粒米”的主要原因。

“沤黄米”是稻谷未及时脱粒干燥而堆放，致使霉变．曳杠罕恍粒变黄。该毒素为含氯环状结构的肽类，无色针状结晶。

有快速肝毒性，染毒后短时间内即可引起肝脏空泡变性、坏死和肝小叶出血；小剂量长时间摄人，可使小鼠肝硬变、干纤维化和癌变。

3．黄绿青霉紊(Citreoviridin)

由黄绿青霉等产生，也是“黄变米”中的霉菌毒素之一。它是深黄色针状结晶。

它具有神经毒、肝毒性和血液毒。其神经毒具有嗜中枢性。

其慢性毒性主要表现于肝细胞萎缩和多形性及贫血。

二检验

1．样品的收集与处理同镰刀菌

2．检验方法

(1)形态学鉴定

A桔青霉：

本菌属于不对称青霉菌，绒状青霉亚群，桔青霉系群。

在察氏琼脂培养基上于24－26度培养10－14天，菌落呈天鹅绒状，灰绿色，外缘呈白色，背面有黄色色素。外线照射下，可见黄色荧光。

B冰岛青霉：

属于双轮对称青霉群；

在察氏璋脂培养基上于室温培养两周，菌落通常具有显著的环带及轻微的放射性皱纹。背面溶出红褐色色素，带有色素颗粒。

分生孢于是卵圆形呈链状排列，壁厚、光滑，呈青灰色或灰绿色。

C 黄绿青霉：

属于单轮青霉群，在察氏琼指培养基上于室温培养12—14天，菌落呈天鹅绒状，中部隆起，有放射状大皱纹，灰绿色，最外侧呈白色。菌落上着生有黄色的水珠。背面溶出红黄色色素。在紫外光下照射菌落背面时可见黄色至棣棠花色的荧光。

显微镜下观察青霉菌的菌丝结构、孢子的形态及排列等特征。

(2)．毒素测定