开堂食品卫生检验课 [复制链接]

• 食品卫生学

1986年，世界卫生组织在题为《食品安全在卫生和发展中的作用》的文件中，曾把“食品安全”与“食品卫生”作为同义词，定义为：“生产、加工、储存、分和制作食品过程中确保食品安全可靠，有益于健康并且适合人消费的种种必要条件和措施”。1996年世界卫生组织在其发表的《加强国家级食品安全性计划指南》中则把食品安全性与食品卫生作为两个概念不同的用语加以区别。目前学术界对于食品安全和食品卫生两个概念的内涵与外延还没有一个统一的认识，常常出现混淆，事实上，按照世界卫生组织1996年在《加强国家级食品安全性计划指南》一文对它们定义的分别表达，也很难将它们严格区分，因此，这有待于有关同行专家对此作进一步的讨论和规范。

（一）、概念

食品安全与卫生学：

研究食品中存在或从环境可能进入食品、能威胁人体健康的有害物质和因素及其评价方法、预防与控制措施，以提高食品卫生质量，保证食用者安全的学科。

（二）、食品卫生学研究内容

1）食品的污染问题

2）各类食品的卫生问题

3）食物中毒等食源性疾病及其预防

4）食品卫生监督管理

它的研究内容主要有食品原料的生产、加工、贮运和产品销售与消费整个过程中可能存在的主要有害物质和因素的种类、来源、性质、作用、含量水平、监督管理以及预防与控制措施，各类食品的主要安全与卫生问题，特别是食物中毒及其预防、控制和管理等。

（三）、食品安全与卫生学的展望

人类食品的安全性正面临着严峻的挑战，解决目前十分复杂而又严重的食品问题需要全社会的共同努力。

在今后一段时间内，我国在保证食品安全方面需要着重开展以下工作：

1、加大人力和物力的投入力度，进行相关理论的研究和技术的开发；

2、以现代食品安全控制的最新理论和技术，不断制定和修订各项食品安全与卫生技术规范，并加以落实；

3、不断完善相应的法律法规，加强法制管理，明确执法机构人员的职责；

4、对食品生产的环境开展有害物的背景值调查，对各种食品中的危害因子进行系统地检测与分析，为食品安全的有效控制提供基础数据和信息；

5、研究食物中毒的新病原物质，提高食物中毒的科学评价水平和管理水平；

6、进一步推广良好操作规范(GMP)和危害分析与关键控制点(HACCP)等有效的现代管理与控制系统；

7、提高食品毒理学、食品微生物、食品化学等学科的研究水平，并将这些研究领域的成果不失时机地应用于食品安全保障工作之中；

8、对全体国民加强新知识、现代技术和食品安全基本常识的宣传与教育，加强相关法制法规约教育，提高广大民众自我保护意识；

9、研究WTO规则中有关食品安全的条例，充分应用和有效工对国际食品贸易中与食品安全相关的技术壁垒，以保护我国的经济利益和广大民众的生命安全；

10、加强国际合作，同FAO、WHO等国际专门机构或组织进行经常性的沟通与合作，不断就世界范围的食品污染物和添加剂的评价、制订ADI值、食品规格、监督管理措施等问题提出意见或建议，维护我国在处理有关食品安全国际事务中的权力和利益。

二、食品微生物检验学

1、概念

微生物的特点。食品中微生物的种类、数量、性质、活动规律与人类健康关系极为密切。微生物与食品的关系复杂，有有益的一面，也有不利的一面，必须经过检验才能确保其安全性。

食品微生物检验学是运用微生物学的理论与技术，研究食品中微生物的种类、特性等，建立食品微生物学检验方法和确定食品卫生的微生物学标准的一门应用性科学。

2、特点

1）研究对象以及研究范围广

食品种类多，各地区有各地区的特色，分布不同，在食品来源、加工、运输等都可能受到各种微生物的污染；微生物的种类非常多，数量巨大。

2）涉及学科多样

食品微生物检验是以微生物学为基础的，还涉及生物学、生物化学、工艺学、发酵学等方面的知识，以及兽医学方面的知识等。根据不同的食品以及不同的微生物，采取的检验方法也不同。

3）实用性及应用性强

本学科在促进人类健康方面起着重要的作用。通过检验，掌握微生物的特点及活动规律，识别有益的、腐败的、致病的微生物，在食品生产和保藏过程中，可以充分利用有益微生物为人类服务，同时控制腐败和病原微生物的活动，防止食品变质和杜绝因食品而引起的病害，保证食品卫生的安全。

4）采用标准化

在食品的卫生质量标准中，有明确的微生物学标准。必须达到法规规定的标准。《中华人民共和国国家标准——食品卫生检验方法》中的具体规定，这是法定的检验依据。

3、目的

目的就是要为生产出安全、卫生、符合标准的食品提供科学依据。

要使生产工序的各个环节得到及时控制，不合格的食品原料不能投入生产，不合格的成品不能投放市场，更不能被消费者接受，因而对食品进行微生物检验至关重要。

4、食品微生物检验的任务

1）研究各类食品中微生物种类、分布及其特性

2）研究食品的微生物污染及其控制，提高食品的卫生质量

3）研究微生物与食品保藏的关系

4）研究食品中的致病性、中毒性、致腐性微生物

5）研究各类食品中微生物的检验方法及标准

5、食品微生物检验的发展

食品微生物检验学的发展是与整个微生物学的发展是分不开的。人类很早就开始利用微生物的许多特性为人类的生产、生活服务，古代人类虽未观察到微生物，但早已将微生物学知识用于工农业生产和疾病防治中，公元前二千多年的夏禹时代，就有仪狄酿酒的记载。北魏（公元386～534年）《齐民要术》一书中详细记载了制醋的方法。长期以来民间常用的盐腌、糖渍、烟熏、风干等保存食物的方法，实际上正是通过抑制微生物的生长而防止食物的腐烂变质。在预防医学方面，我国自古就有将水煮沸后饮用的习惯。明朝李时珍在《本草纲目》中指出，将病人的衣服蒸过后再穿就不会传染上疾病，说明已有消毒的记载。

1）致病菌检测阶段

微生物的发现：首先观察到微生物的是荷兰人吕文虎克（Antory Van Leeuwenhoek，1632～1723）由于航海的需要，有了望远镜。他于1676年用自磨镜片制造了世界上第一架显微镜（约放大300倍），并从雨水、牙垢等标本中第一次观察和描述了各种形态的微生物，为微生物的存在提供了有力证据，并确定了细菌的三种基本形状：球菌、杆菌和螺旋菌，吕文虎克也被称为显微镜之父；从此以后，人们对微生物的形态、排列、大小等有了初步的认识，但仅限于形态学方面，进展不大。其主要原因是自然发生论起阻碍的作用。

19世纪是近代微生物学发展非常迅速的一个时期，法国科学家巴斯德（Louis Pasteur,1822～1895）首先实验证明有机物质的发酵与腐败是由微生物作用的结果，而不是发酵产生了微生物。而酒类变质是因污染了杂菌，从而推翻了当时盛行的自然发生说。巴斯德的研究开创了微生物的生理学时代。人们认识到不同微生物间不仅有形态学上的差异，在生理学特性上亦有所不同，进一步肯定了微生物在自然界中所起的重要作用。自此，微生物开始成为一门独立学科。巴斯德在蚕病、狂犬病、鸡霍乱和炭疽病的病原体研究和预防方面作出了卓越的贡献，他发明的巴氏消毒法至今仍然用于各种液态食品的工业化生产，被称为现代微生物学之父。

19世纪末至20世纪初，在巴斯德和科赫光辉业绩的影响下，国际上形成了寻找病原微生物的热潮。由于国际间交往的增加，尤其是第一次世界大战的爆发，一些烈性传染病的全球性大流行，促使人们必须将视线集中在病原微生物的研究方面，一提到微生物，就会联想到疾病与灾难。有关食品微生物学方面的研究也主要是检测致病菌。

我国从50年代起开始对沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌等食物中毒菌进行调查研究，并建立了各种食物中毒的细菌分离鉴定方法。

2）指示菌检测阶段

在我国，80％的传染病是肠道传染病，为了预防肠道传染病，各种食品微生物的检验方法和检验标准的制定，是食品微生物检验的重要研究内容之一。通过这阿些方法和标准，可以检测并判断水、空气、土壤、食品、日常用品以及各类公共场所的安全卫生状况。但从这些样品中直接检测目的病原微生物有一定的难度，原因是在环境中病原微生物数量少、种类多、生物学性状多样，检验和鉴定的方法比较复杂。因此，需要寻找某些带有指示性的微生物，这些微生物应该在环境中存在数量较多，易于检出，检测方法较简单，而且具有一定的代表性。根据其检出的情况，可以判断样品被污染的程度，并间接指示致病微生物有无存在的可能，以及对人群是否构成潜在的威胁。

指示菌：是在常规安全卫生检测中，用以指示检验样品卫生状况及安全性的指示性微生物。检验指示菌的目的，主要是以指示菌在检品中存在与否以及数量多少为依据，对照国家卫生标准，对检品的饮用、食用或使用的安全性作出评价。

指示菌可分为三种类型：

A 为了评价被检样品的一般卫生质量、污染程度以及安全性，最常用的是菌落总数、霉菌和酵母菌数。

B 特指粪便污染的指示菌，主要指大肠菌群。其他还有肠球菌、亚硫酸盐还原梭菌等。他们的检出标志着检品受过人、畜粪便的污染，而且有肠道病原微生物存在的可能性。

C 其他指示菌；包括某些特定环境不能检出的菌类，如特定菌、某些致病菌或其他指示性微生物。

3）微生态制剂检测阶段

19世纪人们就发现并开始认识厌氧菌（巴斯德，1863），但是到20世纪70年代，了解到厌氧菌主要是无芽孢专性厌氧菌后，才开始重新重视他的研究。厌氧菌广泛分布在自然界、如土壤、沼泽、湖泊、海洋和淤泥，以及动植物体内，尤其是广泛存在于认得皮肤和肠道。他们在人出生后数小时就定居，是人体中存在的主要微生物菌群之一。生态平衡时，与人体“和平共处”。生态失调时，称为人体感染的主要条件致病菌，形成厌氧菌感染症。由此，市场上出现了以乳酸菌、双歧杆菌为主，以调节生态平衡为目的的各种微生态制剂时，检验其菌株的特性和数量就成了20世纪末食品微生物检测的一项重要内容。

4）现代基因工程菌和尚未能培养菌的检测

随着生物化学和分子生物学的发展，促进了微生物学的飞跃发展，从细胞水平进入亚细胞水平及分子水平。随着转基因动物、植物和基因工程菌被批准使用的数目以及进入商品化生产的种类日益增多，食品微生物检测的任务也越大。目前也发现了一些尚未能培养的微生物等。同时，这也促进了食品微生物检验技术的发展。

在微生物的应用技术、实验方法方面也有极其迅速的发展。如电镜技术的进步，再配合生物化学、电泳法、免疫化学等，使人们对各种微生物的特性、抗原构造都有进一步的认识，对微生物的种属作出正确的分类和鉴定。利用荧光抗体技术、单抗技术、PCR技术等，进一步推动微生物学的发展。

现在我国出版了《中华人民共和国国家标准——食品卫生检验方法（微生物学部分）》，统一了全国食品微生物检验方法，对促进食品卫生工作起到一定的作用。

卫生检验机构：

A皇宫种设有专职人员检验食品，利用侍从人员对视品进行试验性品尝；

B建国后，各地建立卫生防疫站，站内设立食品检验科；

C80年代，成立动植物检疫局等

国家食品卫生机构和队伍不断增多和扩大。各卫生检测单位，商业、食品加工单位的化验室，卫生部门设有食品卫生检验所，成立乳肉蛋食品检测中心站等，进行包括食品卫生检验的工作。

随着经济的发展，我国人们的生活水品将有更大的提高，人们对食品卫生的要求也会越来越高。食品微生物检验学，作为给人类提供有益于健康，又能确保食用安全的食品的科学保障之一，受到人们的重视，有着广阔的发展前景。

下面将正式开始！！

第一章 微生物常规鉴定技术

第二章 食品检验样品的采集与处理

第三章 食品微生物检验的指标

第四章 食品中毒性微生物的检验

第五章 常见病原微生物的检测

第六章 肉与肉制品中的微生物及检测

第七章 乳与乳制品中的微生物及其检验

第八章 罐头食品中的微生物及其检测

第九章 其他食品的微生物及其控制

[此贴子已经被作者于2006-6-24 15:26:41编辑过]

第一章微生物检验基本知识

包括显微镜、染色技术、培养基制备技术、接种、分离纯化和培养技术等。

接种、分离纯化和培养技术

一、接种

　　将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。

１、接种工具和方法

　接种和分离工具

1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀

　　常用的接种方法有以下几种：

　　１）划线接种 这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。

　　２）三点接种 在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。

　　３）穿刺接种 在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。

４）浇混接种 该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。

　　５）涂布接种 与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。

　　６）液体接种 从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。

　　７）注射接种 该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些疾病。

　　８）活体接种 活体接种是专门用于培养病毒或其它病原微生物的一种方法，因为病毒必须接种于活的生物体内才能生长繁殖。所用的活体可以是整个动物；也可以是某个离体活组织，例如猴肾等；也可以是发育的鸡胚。接种的方式是注射，也可以是拌料喂养。

２、无菌操作

　　培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。

　　　图5－４　斜面接种时的无菌操作

(1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞

二、分离纯化

　　含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（Mixed culture）。如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（Pure culture）。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化，方法有许多种。

１、倾注平板法

　　首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在40-50°左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。（图5－５，a）

图5－５　倾注平板法（a）涂布平板法（b）图解

1.菌悬液 2.熔化的培养基 3.培养物 4.无菌水

２、涂布平板法

　　首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。（图5－５，b）

３、平板划线法

　　最简单的分离微生物的方法是平板划线法。用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。（图5－６）当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。（图5－７）

４、富集培养法

　　富集培养法的方法和原理非常简单。我们可以创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌。

　　图5－６　平板划线分离法

1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法

５、厌氧法

　　在实验室中，为了分离某些厌氧菌，可以利用装有原培养基的试管作为培养容器，把这支试管放在沸水0浴中加热数分钟，以便逐出培养基中的溶解氧。然后快速冷却，并进行接种。接种后，加入无菌的石蜡于培养基表面，使培养基与空气隔绝。另一种方法是，在接种后，利用N2或CO2取代培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。有时为了更有效地分离某些厌氧菌，可以把所分离的样品接种于培养基上，然后再把培养皿放在完全密封的厌氧培养装置中。

三、培养

1、根据培养时是否需要氧气，可分为好氧培养和厌氧培养两大类。

　　好氧培养：也称“好气培养”。就是说这种微生物在培养时，需要有氧气加入，否则就不能生长良好。在实验室中，斜面培养是通过棉花塞从外界获得无菌的空气。三角烧瓶液体培养多数是通过摇床振荡，使外界的空气源源不断地进入瓶中。

　　厌氧培养：也称“厌气培养”。这类微生物在培养时，不需要氧气参加。在厌氧微生物的培养过程中，最重要的一点就是要除去培养基中的氧气。一般可采用下列几种方法：

a.降低培养基中的氧化还原电位：常将还原剂如谷胱甘肽、硫基醋酸盐等，加入到培养基中，便可达到目的。有的将一些动物的死的或活的组织如牛心、羊脑加入到培养基中，也可适合厌氧菌的生长。

b.化合去氧：这也有很多方法，主要有：用焦性没食子酸吸收氧气；用磷吸收氧气；用好氧菌与厌氧混合培养吸收氧气；用植物组织如发芽的种子吸收氧气；用产生氢气与氧化合的方法除氧。

c.隔绝阻氧：深层液体培养；用石蜡油封存；半固体穿刺培养。

d.替代驱氧 用二氧气碳驱代氧气；用氮气驱代氧气；用真空驱代氧气；用氢气驱代氧气；用混和气体驱代氧气。

２、根据培养基的物理状态，可分为固体培养和液体培养两大类。

　　固体培养：

　　液体培养：

三、培养

1、根据培养时是否需要氧气，可分为好氧培养和厌氧培养两大类。

　　好氧培养：也称“好气培养”。就是说这种微生物在培养时，需要有氧气加入，否则就不能生长良好。在实验室中，斜面培养是通过棉花塞从外界获得无菌的空气。三角烧瓶液体培养多数是通过摇床振荡，使外界的空气源源不断地进入瓶中。

　　厌氧培养：也称“厌气培养”。这类微生物在培养时，不需要氧气参加。在厌氧微生物的培养过程中，最重要的一点就是要除去培养基中的氧气。一般可采用下列几种方法：

a.降低培养基中的氧化还原电位：常将还原剂如谷胱甘肽、硫基醋酸盐等，加入到培养基中，便可达到目的。有的将一些动物的死的或活的组织如牛心、羊脑加入到培养基中，也可适合厌氧菌的生长。

b.化合去氧：这也有很多方法，主要有：用焦性没食子酸吸收氧气；用磷吸收氧气；用好氧菌与厌氧混合培养吸收氧气；用植物组织如发芽的种子吸收氧气；用产生氢气与氧化合的方法除氧。

c.隔绝阻氧：深层液体培养；用石蜡油封存；半固体穿刺培养。

d.替代驱氧 用二氧气碳驱代氧气；用氮气驱代氧气；用真空驱代氧气；用氢气驱代氧气；用混和气体驱代氧气。

２、根据培养基的物理状态，可分为固体培养和液体培养两大类。

　　固体培养：

　　液体培养：

第二章微生物常规鉴定技术

一、形态结构和培养特性观察

１、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。

２、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。

不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同一种的细菌在一定条件下，培养特征却有一定稳定性。以此可以对不同微生物加以区别鉴定。因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。

　　１）细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。（图３－８）

图３－８　细菌的培养特征

1.点状 2.圆形 3.丝状 4.不规则形 5.假根状 6.纺锤状 7.扁平 8.隆起 9.凸起 10.垫状 11.脐状 12.边缘整齐 13.波状 14.裂片状 15.啮蚀状 16.丝状 17.卷发状 18.丝线状 19.刺毛状 20.串珠状 21.疏展状 22.树根状 23.假根状 24.丝状 25.串珠状 26.乳头状 27.绒毛状 28.树根状 29.量杯状 30.萝卜状 31.漏斗状 32.囊状 33.层状 34.絮状 35.环状 36.蹼状 37.膜状