开堂食品卫生检验课 [复制链接]

第四章　　食品中毒性微生物的检验

第一节 食物中毒概述

一、食物中毒的概念和分类 （一）、概念 食源性疾病：指通过摄食进入人体内的各种治病因子引起的、通常具有感染性质或中毒性质的一类疾病。 食物中毒：是指健康人经口摄人正常数量食品后，所引起的以急性病理过程为主的疾病。 微生物性食物中毒： 食用被微生物或微生物毒素污染的食品而引起的中毒称为微生物性食物中毒。 发病原因多见于食用了食物中毒性微生物或其毒素，有毒化学物质，有毒生物组织(如甲状腺、脑垂体、肾上腺、毒鱼、有毒食用菌等)以及食品引起的变态反应等。 食物中毒属食源性疾病的范畴，是食源性疾病中最为常见的疾病。食物中毒步不包括因暴饮暴食而引起的急性胃肠炎、食源性肠道传染病(如伤寒)和寄生虫病(如旋毛虫病、囊虫病)，也不包括因一次大量或长期少量多次摄人某些有毒、有害物质而引起的以慢性毒害为主要特征的疾病。 （二）、食物中毒的分类 一般按病原物质，将食物中毒分为五类。 1．细菌性食物中毒是指摄人含有细菌或细菌毒素的食品而引起的食物中毒。 2．真菌及其毒素食物中毒是指摄人被真菌及其毒素污染的食物而引起的食物中毒 3．动物性食物中毒是指摄人动物性中毒食品而引起的食物中毒。 4．有毒植物中毒是指摄人植物性中毒食品引起的食物中毒。 5．化学性食物中毒是指摄人化学性中毒食品引起的食物中毒。

（三）、细菌性食物中毒

细菌性食物中毒：

是指人们吃了被大量活的食物c霉些组瀛或绷嘘产生的毒素污染韵食品所引起的中毒现象。

近几年来统计资料表明，我国发生的细菌性食物中毒是食物中毒较为常见，其次为副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌食物中毒。细菌性食物中毒可分为感染型食物中毒、毒素型食物中毒和混合型食物中毒。

1．感染型食物中毒

指食物被污染并繁殖了大量食物中毒性微生物(包括病原菌和条件致病菌)，如沙门氏菌、致病性大肠杆菌、副溶血性弧菌、变形杆菌、蜡样芽胞杆菌，魏氏梭菌、耶尔森氏菌、嗜盐菌、枯草杆菌及劈球菌等，这种含有大量活菌(一般含菌数在107个／g以上)的食物被摄入机体后，引起一系列消化道症状的现象，称为感染型食物中毒，此类中毒是由细菌本身引起的。

发病机制：病原菌随食物进入肠道，在肠道内继续生长繁殖，靠其侵袭力附于肠黏膜或侵入黏膜及黏膜下层，引起肠黏膜充血、白细胞浸润、水肿、渗出等炎性病理变化。某些病原菌如沙门氏菌进入黏膜固有层后可被吞噬细胞吞噬或杀灭，病原菌菌体裂解后释放出电壹塞，内毒素可作为致热源刺激体温调节中枢引起体温升高，亦可协同致病菌作用于肠黏膜，引起腹泻等胃肠道症状。

2．毒素型食物中毒

食物被能产生毒素的微生物如葡萄球菌、肉毒梭菌、魏氏梭菌等污染，并在适宜的条件下生长繁殖，产生了某种毒素，这种毒素同污染的微生物一起或单独随食物被摄人人体后，所引起的一系列中毒现象，称为毒素型食物中毒。

此种中毒主要是细菌产生的大量毒素所引起的，如葡萄球菌肠毒素，魏氏梭菌毒素引起的食物中毒及肉毒毒素引起的食物中毒等，均属于毒素型食物中毒。

3．混合型食物中毒

有的细菌性食物中毒。聂具有甚染型食物中毒的特征，又具有毒素型食物中毒的特征，称为混合型食物中毒。如魏氏梭菌、 蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒。这种中毒在检验时，应特别重视对其毒素的测定。

副溶血性弧菌等病原菌，进入肠道除侵入黏膜引起肠黏膜的炎性反应外，还可以产生肠毒素引起急性胃肠道症状。这类病原菌引起的食物中毒是致病菌对肠道的侵入及其产生的肠毒素的协同作用，因此，其发病机制为混合型。

(四)细菌性食物中毒的临床特征

1．感染型食物中毒的临床特征

1）潜伏期短，一般几小时到24小时，平均为12小时左右，潜伏期长短主要与进入机体的细菌量及个体体质状况有关。

2）病程短，通常为1—3天，个别细菌可长达7～14天，如沙门氏菌3－7天、小肠结肠炎耶尔森氏菌为3—14天，溶血性链球菌为2—7天等。

3）发病症状以急性胃肠炎为主。

表现为恶心、呕吐、腹泻，体温升高、头痛等。从病人和原因食品中均可分离出相同的病原微生物。

2．毒素型食物中毒的临床特征

1）潜伏期长短不一，如金黄色葡萄球菌肠毒素所引起的中毒潜伏期为2—5小时；肉毒素中毒潜伏期2小时到10天，甚至10天以上。

2）病程长短不一，如金黄色葡萄球菌毒素中毒能够迅速痊愈，而肉毒毒素中毒则恢复很慢，一般为2—3天，长的达2—3周。

3）胃肠型症状不明显．如葡萄球菌肠毒素所引起的中毒虽有频繁的呕吐、腹痛，但腹泻很少见，体温正常或微升高。肉霉毒素所引起的中毒，虽然初期表现为恶心、呕吐，有时有腹泻，但其主要症状为痉挛乏却坤经失调、分泌机能失调等神经症状和虚脱，出现不能抬头、瞳孔放大、光反应迟钝，言语困难、吞咽不易、呼吸不畅等。

(三)霉菌毒素性食物中毒

1、是指某些霉菌如黄曲霉菌、赭曲霉菌污染了食品，并在适宜条件下繁殖，同时产生了毒素，这些毒素达到一定量后，随被污染的食品一同摄人人体内而引起的食物中毒。

2、当霉菌毒素的量很小时，则不能引起食物中毒．但长期少量摄入某种霉菌毒素，则可导致癌症或发生“三致”（致癌、致畸、致突变）作用。

要禁止使用发霉的原料生产食品和使用发霉的饲料饲养动物。

二、微生物性食物中毒的特点

1．与饮食有关，不吃者不发病

2．引起中毒的原因食品除掉后，不再有新的患者发生

3．发病呈暴发性：

微生物性食物中毒和其他食物中毒一样，突然发生，根据食用原因食品的人数不同，可有数百人致数千人同时发病，而且表现的临床症状一致。

4．发病季节性强

一般多发生在4—10月份，6～9月进入高峰期，这主要与这段时间气温高、微生物易于生长繁殖和人们的饮食习惯(吃凉食，冷饮较多)有关。

5．中毒症状以急性胃肠炎为主，不具有传染性

微生物性食物中毒中经常发生的是细 菌性食物中毒，因此在症状上多数都具有恶心、呕吐、腹痛、腹泻等急性胃肠炎症状，而且不相互传染。

6．从病人和原因食品中均可检测到同样的病原微生物或微生物毒素

发生微生物性食物中毒时，都能从病人急性发病期的呕吐物、血液及后期的粪便中和引起中毒的食品中分离到同一血清型的微生物或微生物毒素。

三、引起微生物性食物中毒的原因

发生微生物性食物中毒的根本原因是食品受到了某些微生物或微生物毒素的污染，微生物污染的原因有内源性污染和有外源性污染，其中外源性污染是经常性的和主要的，概括起来主要有以下几个方面：

1．食品原料受到了污染

2．生产、加工、运输、销售及食用过程中的污染

3．加工方法不当

主要是某些大块食品在烧煮时时间太短或温度太低，不能足以杀死微生物，或油炸食品时中心未熟透等。

4．交叉污染

在食品制作时，发生了生熟食品交叉污染，如用盛放过生食品的容器、用具、刀板等与熟食品发生接触，而导致生食品中的某些微生物污染到熟食品上，这种熟品在食用前没有经过再加热或加热温度不足以杀灭污染的微生物。

5．工作人员的污染

接触食品的工作人员的个人卫生状况不良，如患有某种肠道传染病或带菌，则可以将这种病原微生物污染到食品上而导致食物中毒或食物感染。

四、微生物性食物中毒的预防

微生物性食物中毒常常给人类带来严重的危害。是食品卫生检验的重要内容之一。

1．严格执行有关法规

严格遵守国家颁布《中华人民共和国食品卫生法》和其他有关的条例、规定，以及各地区制定的各种规定与卫生要求．加强食品卫生的检验与监督工左。

2．严格防止食品污染

3．控制微生物在食品上的繁殖

一般食物中毒性细菌的最适生长温度在35+37℃；绝大部分在低温下即停止繁殖或缓慢繁殖，因此，低温贮存食品是控制污染微生物在食品上繁殖的重要措施。

4．杀灭污染食品中的微生物

杀灭食品中微生物的方法很多，如降低食品pH值、提高食品的渗透压(盐腌、糖溃)、采用紫外线照射或其它辐射线照射和加热灭菌等；其中加热灭菌法对微生物的杀灭最为彻底，这在食品罐头生产中已广泛应用。

5．加强食品卫生检验和宣传工作

第二节 　　沙门氏菌及其检验

沙门氏菌(Salmonella)可引起混合型的食物中毒。 一是内源性污染； 二是外源性污染。由于沙门氏菌的分布广，如果畜禽粪便污染了食品加工场所的环境或用具，就会造成食品在加工、运输、贮存、销售及动物屠宰等环节受到沙门氏菌的污染。一旦条件适宜，沙门氏菌就会迅速的生长繁殖，当菌数在食品中达到一定数量，被消费者食用后就会造成食物中毒，危害人的身体健康，甚至危及生命。 在微生物分类学中，沙门氏菌属是肠杆菌科的一个大属，包括2000多个血清型，它们在形态结构、培养特性、生化特性和抗原构造方面都非常相似，是一类形态短小的革兰氏阴性杆菌，主要寄居于人和其它温血动物的肠道中，可引起多种性质的疾病，根据沙门氏菌的致病范围，可将其分为三大类群。 第一类群：专门对人致病。如伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌， 乙型副伤寒伤门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌。 第二类群：能引起人类食物中毒，称之为食物中毒沙门氏菌群，如鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、纽波特沙门氏菌等。 第三类群：专门对动物致病，很少感染人，如马流产沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌，此类群中尽管很少感染人，但近年也有感染人的报道。 沙门氏菌属（Salmonella）是一大群寄生于人类和动物肠道内生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌统称为沙门氏杆菌。1880年Eberth首先发现伤寒杆菌，1885年Salmon分离到猪霍乱杆菌，由于Salmon发现本属细菌的时间较早，在研究中的贡献较大，遂定名为沙门氏菌属。此菌可引起禽伤寒、鸡白痢、猪霍乱、鼠伤寒沙门氏菌、猪副伤寒、马流产沙门氏菌等疾病。致病性最强的是猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholerae)，其 次是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)和肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)。

一、生物学特性

1、形态染色特性

革兰氏阴性、两端钝圆的短杆菌（比大肠杆菌细），（0.7～1.5um）×（2～5um）散在，无荚膜和芽胞，（除鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌外）都具有周身鞭毛，能运动，大多数具有菌毛，能吸附于宿主细胞表面或凝集豚鼠红细胞。

2．培养特性

1）需氧及兼性厌氧菌

2）在普通琼脂培养基上生长良好，培养24小时后，形成中等大小、圆形、表面光滑、无色半透明、边缘整齐的菌落，其菌落特征亦与大肠杆菌相似（无粪臭味）。

3）鉴别培养基（麦康凯、SS、伊红美兰）：一般无色菌落

4）三糖铁琼脂斜面：斜面为红色，底部变黑并产气。

3．生化特性

1）发酵葡萄糖，麦芽糖，甘露醇和山梨醇产气；

2）不发酵乳糖、蔗糖和侧金盏花醇；

3）不产吲哚、V-P反应阴性；

4）不水解尿素和对苯丙氨酸不脱氨。

伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌及一部分鸡白痢沙门氏菌发酵糖不产气，大多数鸡白痢沙门氏菌不发酵麦芽糖；除鸡白痢沙门氏菌、猪伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和仙台沙门氏菌等外，均能利用枸橼酸盐。

4．血清学特性

沙门氏菌具有复杂的抗原结构，一般沙门氏菌具有菌体(O)抗原、鞭毛(H)抗原和表面抗原(荚膜或包膜抗原)三种抗原，见表5-3。

1）O抗原（菌体抗原）

a存在于菌体表面，为脂多糖，多糖部分决定其特异性，

b性质稳定，耐热性强，100℃ 2h不破坏。

c一个菌体具有一种或多种不同的O抗原。

d沙门氏菌的O抗原共有65种，以阿拉伯数字1、2、3、4……代表．

2）、H抗原

a、H抗原存在于鞭毛中,不耐热，化学成分蛋白质，其抗原性可以被酒精所破坏。

b、H抗原可分为两相

第1相：为特异相，用小写英文字母表示，a～z，Z以后则从z1、z2……，已编到z83。

第2相：为非特异相以阿拉伯数字表示，共7种。

具有第1相和第2相H抗原的细菌称为双相菌，大多数沙门氏菌属于此；仅有一相者称单相菌，如肠炎沙门氏菌。每一组沙门氏杆菌根据H抗原不同，可进一步分种或型。极少数无鞭毛菌两相抗原都不具有，称为无相菌，如鸡白痢沙门氏菌。H抗原刺激机体主要产生lgG抗体。

3） Vi抗原为包膜抗原

少数沙门氏菌，如伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌的新分离菌株，常具有这种包膜抗原，经过几次传代、60C热处理或石炭酸处理后容易消失。

5、抵抗力

沙门氏菌属不耐热，55C 1h、60 C 15—30min即被杀死。

沙门氏菌属在外界的生活力较强，在10C～42C的范围内均能生长，最适生长温度为37C。最适生长的pH值为6.8—7.8。

在普通水中虽不易繁殖，但可生存2—3周。在粪便中可存活1—2个月。

在牛乳和肉类食品中，存活数月，在食盐含量为10％－15％的腌肉中亦可存活2—3个月。

烹调大块鱼、肉类食品时，如果食品内部达不到沙门氏菌的致死温度，其中的沙门氏菌仍能存活，食用后可导致食物中毒。冷冻对于沙门氏菌无杀灭作用，即使在-25℃低温环境中仍可存乏10个月左右。

由于沙门氏菌属不分解蛋白质，不产生靛基质，污染食物后无感官性状的变化，易被忽视而引起食物中毒。

6．毒素特性

沙门氏菌不产生外毒素，但菌体裂解时．可产生毒性很强的内毒素，此种毒素为致病的主要因素，可引起人体发冷、发热及白细胞减少等病症。

二、致病性

1、沙门氏菌经口进入人体以后，在肠道内大量繁殖，经淋巴系统进入血液，造成一过性菌血症，即感染过程。

2、随后，沙门氏菌在肠道和血液中受到机体的抵抗而被裂解、破坏，释放大量内毒素，使人体中毒，出现中毒症状。

三、主要症状

急性胃肠炎。

潜伏期为6—12小时，最长可达24小时，病人临床表现为恶心、头痛、出冷汗、面色苍白，继而出现呕吐、腹泻、发热，体温高达38~C一40C，大便水样或带有脓血、粘液，中毒严重者出现寒战、惊厥、抽搐和昏迷等，此菌中毒死亡率较低。

四、流行病学特点

1．季节性特点全年皆可发生，多见于夏、秋两季。5—10月发病起数和发病人数可达全年发病总起数和总人数的80％。

2．食品种类沙门氏菌食物中毒的食品主要为动物性食品，特别是畜肉类及其制品，其次为禽肉、蛋类、乳类及其制品，由植物性食品引起者很少。

3．食品中沙门氏菌的来源由于沙门氏菌属广泛分布于自然界，在人及动物，如家畜中猪、牛、马、羊、猫、犬，家禽中鸡、鸭、鹅等均有广泛的宿主，因此，沙门氏菌污染肉类食物的几率很高。

（1）家畜、家禽的生前感染和宰后污染。

(2)乳中沙门氏菌的来源。患沙门氏菌病的奶牛其乳中可能带菌，即使是健康奶牛的乳在挤出后亦容易受到污染。亦容易受到污染。

(3)蛋类沙门氏菌的来源。

蛋类及其制品感染或污染沙门氏菌的机会较多，尤其是鸭、鹅等水禽及其蛋类，其带菌率一般在30％一40％之间。家禽及蛋类沙门氏菌除原发和继发感染使卵巢、卵黄、全身带菌外，禽蛋在经泄殖腔排出时，粪便中的沙门氏菌污染肛门腔内的禽蛋蛋壳，并可通过蛋亮气孔侵入蛋内。

(4)熟制品中沙门氏菌的米源。

烹调后的熟制晶可再次受到带菌容器、烹调工具等污染或食品从业人员带菌者的污染。

(5)发病率及影响因素。

沙门氏菌食物中毒发病率较高，占总食物中毒的40％一60％，最高可达90％。沙门氏菌致病力强弱与菌型有关，致病力越强的菌型越易致病，猪霍乱沙门氏苗致病力最强，其次为鼠伤寒沙门氏菌，鸭沙门氏菌致病力较弱；对于幼儿、停弱老人及其他疾病患者等易感性较商的人群，即便是较少菌量或较弱致病力的菌型仍可引起食物中毒，甚至出现较重的临床症状。

五、检验

食品中沙门氏菌的检验方法，应按《中华人民共和国国家标准——食品卫生检验方法(微生物学部分)》的沙门氏菌检验方法(GB4789．4-84)进行，其检验程序如图5-1。

（一）、增菌培养

冻肉、蛋品，乳品及其它加工食品首先需要进行前增菌。

1、取样25g (m1)，加入225ml缓冲蛋白胨水中。固体食品可先用均质器以8000～10000转／分打碎1分钟，或用乳钵加灭菌砂磨碎；粉状食品用灭菌匙或玻璃棒研磨使其乳化。

2、36+1℃培养4小时，移取10ml接种于100ml氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42C培养18～24小时。同时，另取10ml，加入于100ml亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36+1℃培养18～24小时。

鲜肉，鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌，各取25g(m1)加入灭菌生理盐水25ml按上述方法做成匀浆，取其半量接种于100ml氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42C培养18～24小时；另一半量接种于100ml亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36+1℃培养18—24小时。

（二）、分离培养

用铂金耳取一环增菌液分别划线接种于：

亚硫酸铋琼脂平板(BS)和DHL琼脂平板(或HE琼脂平板、SS琼脂平板)各一个，于36+1℃分别培养18—24小时(DHL、HE、SS)或40—48小时(BS)。观察各个平板上生长的菌落，沙门氏菌属亚属工、Ⅱ、Ⅳ、V和Ⅲ型在各个平板上的菌落特征见表5-4。

（三）、生化试验

挑取选择性琼脂平板上的可疑菌落，接种于三糖铁琼脂培养基中。在三糖铁琼脂内，各菌属的主要反应结果如表5—5。

表5—5说明在三糖铁琼脂内只有斜面产酸同时H2S阴性的菌株可排除，其他的反应结果均有沙门氏菌的可能，同时均有不是沙门氏菌的可能，都需要作进一步的生化试验，必要时作涂片染色镜检(沙门氏菌为革兰氏阴性短杆菌)。

接种三糖铁琼脂的同时，还要接种蛋白胨水，pH7.2尿素琼脂、KCN培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各一管，于36+1℃培养18～24小时，必要时可延长至48小时，按表5-6判定结果。沙门氏菌的结果应属于Al、A2和Bl，其他五种反应结果均可以排除。

反应序号Al，典型反应判定为沙门氏菌属。如果尿素、KCN和赖氨酸三项中有一项异常，按表5-7仍可判定为沙门氏菌，如有两项异常，则按A3判定为枸橼酸杆菌。

（四）、血清学分型鉴定

用分离出的沙门氏菌与已知A-F多价O血清及H因子进行玻片凝集试验。

1、抗原的准备

2、O抗原的鉴定

用A—F多价O血清做玻片凝集试验，以生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株；不能分型。

3、H抗原的鉴定

4、Vi抗原的鉴定

（五）、菌型的判定和结果报告

综合以上生化试验和血清学分型鉴定的结果，按照常见沙门氏菌抗原表及其补充表判定菌型。并报告结果。

目前，对于沙门氏菌的检验技术已有很大进展．一些快速检验方法已有应用。如荧光抗体技术检验食品中沙门氏菌已在国际二得到公认，其些国家作为商品生产的荧光抗体试剂箱．即可应用于沙门氏菌的快速检验。我匡在这方面也取得一定的进展，如固相载体吸附免疫技术、免疫染色法，酶联A蛋白染色等快速检验方法均具有快速、方便、经济和准确等特点，还有许多新方法、新技术仍处在实验和研究阶段，有待于我们去研究探讨，以便更好服务于实践。

第三节　　致病性大肠埃希氏菌及其检验

致病性大肠埃希氏菌是指能使人、动物(尤其是婴儿和幼龄动物)感染及人食物中毒的一群大肠杆菌。 在自然界中本菌分布广泛，主要寄居场所是人和其它温血动物的肠道中，是一类条件性致病菌。致病性大肠埃希氏菌的形态特点、培养特性和生化特性均与非致病性大肠埃希氏菌非常相似，以至难以区分，只能通过血清学的方法，从抗原结构的差异来区别。在致病性大肠埃希氏菌中，有些血清型能够引起人的食物中毒，有些血清型能够引起人的肠道内外感染。还有一些血清型的菌株能够使畜禽发病，危害畜牧业，降低畜产食品的质量。致病性大肠埃希氏菌可从饮用水，未消毒牛乳，病畜脏器、禽类及其人畜粪便污染的各种食品中分离出来。 致病性大肠埃希氏菌属主要分为五大类，首先根据发病机理分为三大类， 1、产毒素型大肠埃希氏菌(ETEC)， 2、侵袭型大肠埃希氏菌(EIEC) 3、肠道致病性大肠埃希氏菌(EPEC) 近来又提出另外两类 4、即出血性大肠埃希氏菌(EHEC) 5、肠粘附性大肠埃希氏菌(EAEC) 但是，致病性大肠埃希氏菌的致病性是一个很复杂的问题，也并非由某一方面的因素所决定。 致病性大肠埃希氏菌中，一般认为能产生耐热{ST)和不耐热(LT)肠毒素的两种菌株均可引起人的食物中毒。引起大肠埃希氏菌币毒的主要是一些动物性食品，如乳与乳制品、肉类、水产品等，牛和猪是传播这种病菌、引起中毒的主要原因。 1996年7月在日本就发生了大肠杆菌0157型引起的食物中毒，造成9017多人中毒，10人死亡，其原因与生食萝卜苗有关，其中92例并发出血性肠炎及出血性尿毒症。2001年，再江苏、安徽等地爆发的肠出血性大肠杆菌0157:H7食物中毒，造成177人死亡，中毒人数超过2万人。 如仔猪黄、白痢、猪水肿病、牛腹泻和败血症等均可由大肠杆菌引起。

一、生物学特性

1．形态与染色特性

菌体两端钝圆、中等大小，杆状(有时呈卵圆形)、1—3um X 0.6um、周生鞭毛，能运动，不产生荚膜，革兰氏阴性，而且一般是对碱性染料着色较好，但有时两端着色较浓，要与巴氏杆菌区分开来。

2．培养特性

1)需氧及兼性厌氧菌

2)对营养的要求不高，在普通琼脂上就生长良好，在15C-45℃范围内均可生长，但最适生长温度为37℃，最适pH为7.2—7.4。

3)在普通琼脂平板上培养24小时，可形成圆形、凸起、光滑、湿润、半透明、边缘整齐、中等大小的菌落．其菌落与沙门氏菌比较相似，但是，大肠杆菌菌落对光(45角折射)观察可见荧光。

4)在肉汤培养基中生长18～24小时变为均匀浑，而后底部出现粘性沉淀物，并伴有臭味。

5）部分菌落可出现β溶血。

6）在远藤琼脂上长成带金属光泽的红色菌落

7）在S．S琼脂平板上多不生长，少数生长的细菌，也因发酵乳糖产酸而形成红色菌落；

8）在伊红美兰琼脂上形成具有金属光泽的黑色菌落

9）在麦康凯琼脂上培养24小时后孤立菌落呈红色

3．生化特性

1）可发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇产酸产气，有些不典型的菌株不发酵或迟缓发酵乳糖；

2）不同菌株对蔗糖，卫矛醇、水杨苷发酵结果不一致。

3）本菌可使赖氨酸脱鞍、不能使苯丙氨酸脱羧。

4）不产生H2S，不液化明胶，不分解尿素，

5）、不能在氰化钾培养基上生长，靛基质试验阳性，V-P试验阴性，不利用枸橼酸盐。后四项生化特性是典型的大肠埃希氏菌，与此不一致的即为非典型大肠埃希氏菌菌。

IMViC试验：如IMViC试验为+、+、-、-，且乳糖发酵，表明被检物已有粪便污染，有发生肠道传染病的危险，这是卫生细菌中常用的检测指标。（I：吲哚形成试验，M：甲基红试验，Vi：V-P试验，C：枸橼酸盐利用试验）

4.血清学特性

大肠埃希氏菌的抗原构造主要由菌体抗原(O)，鞭毛抗原(H)和荚膜抗原(K)三部分组成。

1）O抗原

成分为细胞壁上的糖、类脂和蛋白质复合物，也是细菌的内毒素，热稳定性较强，高压蒸汽处理2小时不被破坏。每一血清型只含有一种O抗原，本菌已发现有167种O抗原，分别以阿拉伯数字表示。

2）H抗原

为蛋白质；一种大肠埃希氏菌只有一种H抗原，无鞭毛则无H抗原，H抗原能在80度被破坏，也能被酒精破坏。H抗原共有64种。

3）K抗原

是细胞外部的荚膜或的表面物质，又称包膜抗原。新分离的大肠埃希氏菌70％具有K抗原。根据K抗原耐热的敏感性．可把K抗原分为A、B、L三类，共有103种，致病性大肠埃希氏菌的抗原主要为B抗原，少数为L抗原，B抗原与L抗原均可在煮沸后被破坏，A抗原耐热性强，可耐受煮沸1小时而不被破坏。，

O抗原可将大肠埃希氏菌分成若干血清群，再根据K抗原和H抗原进一步分为若干个血清型或亚型，根据大肠埃希氏菌抗原的鉴定结果，写出其抗原式如O111：K58(B)H12，一般认为H抗原与致病性无关，因此，一般不需要进行H抗原的鉴定。

5．抵抗力

抵抗力中等，各菌型之间存在差异。此菌对青霉素有中等抵抗力，对一般消毒剂都比较敏感。对氯尤为敏感，水中游离氯达到0．2mg／L时，即可杀死此菌。此菌在土壤中、水中及粪便中可存活数月以上。

6．毒素特性

有些大肠埃希氏菌产生肠毒素，

1）不耐热(LT)肠毒素（heat-labile enterotoxin，LT）：化学成分为蛋白质，分子量较大，60℃ 30分破坏，具有免疫原性，可引起肠道分泌增加，出现腹泻。

（2）、耐热肠毒素（heat-stable enterotoxin，ST）：分子量较小，无抗原性，100℃ 30分钟，仍有活性，可引起肠分泌增加。

二、致病性

致病性大肠埃希氏菌属引起酌食物中毒主要有两种类型，一种是肠道内感染，另一种是肠道外感染，两者具有不同的机理和症状：

1．肠道内感染

1）、肠毒素型大肠杆菌（ETEC）：主要引起腹泻（幼畜或雏鸡），约有40个血清型。肠毒素型菌株进入肠道后主要在小肠内繁殖，不损害肠上皮细胞。繁殖过程中产生肠毒素。

2）、肠致病型大肠杆菌（EPEC）：是引起婴儿腹泻的主要病原菌，该菌不产肠毒素，也无侵袭力，致病机理不清，约有18个血清型。

3）、肠侵袭型大肠杆菌（EIEC）：较少见，该菌不产肠毒素，但侵袭大肠肠壁上皮细胞，引起炎症反应，形成溃疡，约有8个血清型。引起类似痢疾的症状。

2．肠道外感染

三、主要症状

肠道内感染主要造成腹泻与痢疾样疾病；肠道外感染主要引起尿路感染，新生儿脑膜炎、败血症及其他部位的感染。

致病菌引起的食物中毒是感染型和毒素型的综合作用，致病性大肠杆菌引起的食物中毒主要症状为急性肠胃炎，潜伏期为12～24小时，临床出现呕吐、腹泻、发热(体温一般不超过39℃)、头痛、腹痛等，病程一般为1—3天。

四、流行病学特点

1、发病季节 多发生在夏秋季

2、引起中毒的食品种类

与沙门氏菌相同。

3、食品种大肠埃希氏菌的来源

由于大肠杆菌存在于人和动物的肠道中，健康人肠道致病性大肠埃希氏菌率为2—8％，高者达44％，而成人患肠炎、婴儿患腹泻时，致病性大肠埃希氏菌率较健康人高，达29—52％。大肠杆菌随粪便排出而污染水源和土壤，进而直接或间接污染食物。

五、检验

致病性大肠埃希氏菌的检验应按《中华人民共和国国家标准——食品卫生检验方法(微生物学部分)》(GB489．6-84)的有关内容进行检验。其检验程序如图5－2。·

（一）、增菌培养

1、以无菌操作的方法称取样品25g，加入225ml营养肉汤培养基中，可用灭菌砂在研钵中磨碎或以均质器打碎样品。

2、取适量接种于乳糖胆盐培养基中，测定大肠菌群MPN，其余移入500ml三角瓶中于36±1℃培养6小时。挑取一环，接种于一管30ml肠道菌增菌汤中，42℃增菌培养18小时。

（二）、分离培养

1、将乳糖胆盐发酵阳性管液与增菌液分别划线接种于麦康凯或伊红美兰琼脂平板上。

2、于36±1℃培养18—24小时观察菌落

对于污染严重的食品可直接按划线法接种，不经过增菌过程。

（三）、生化试验

1、初筛试验

选取在麦康凯或伊红美兰平板上发酵乳糖或不发酵乳糖的菌落5个以上，分别接种于克氏双糖铁、pH7.2尿素和阿拉伯糖中．经36C培养18～24小时，弃去H2S阳性或尿素酶阳性或阿拉伯糖阴性的培养物。

2、复筛试验

把筛留下的培养物分别接种于缓冲葡萄糖蛋白胨和KCN培养基中，经36+1℃培养48小时，观察生长结果并做V-P试验，弃去V-P阳性及KCN阳性的培养物。

3、证实试验

致病性大肠埃希氏菌属除氧化酶阴性，革兰氏阴性的特征以外，还有以下特性：葡萄糖产酸+，葡萄糖产气+／一，乳糖产酸+90％，柠檬酸盐—，尿素酶一，KCN-，V-P-，动力+或—，阿拉伯糖十，靛基质十95％：可按这些主化特性进一步证实其是否为致病性大肠埃希氏菌属。

（四）血清学试验

1、致病性大肠埃希氏菌血清学试验

假定试验：

从平板上选菌落生长稠密处挑取培养物，用致病性大肠埃希氏菌三种OK多价血清做玻片凝集试验。不凝集的培养物可做阴性报告。

证实试验：

2、侵袭性大肠埃希氏菌血清学试验

在平板上菌落生长稠密处挑取培养物，用侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清做玻片凝集试验，侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清包括两种：OK多价血清和9种OK单价血清：

（五）、产肠毒素大肠埃希氏菌毒素试验

1、动物试验

将经过生化证实试验的大肠埃希氏菌培养物接种肉汤管，于36+1℃培养24小时，3000转／分离心30分钟。取上清液用G6滤器过滤后分作两份，一份加热60℃30分钟，供ST测定用，另一份不加热，供LT测定用。

1）家免结轧回肠段试验：

取体重为2kg的家兔，禁食使肠内容物排空。麻醉后剖腹，取出回肠段，按10～15cm为一段，分段结扎，取一段注射肉汤2mL作为阴性对照，另一段注射已知产毒菌肉汤培养物的上清液2ml作为阳性对照。其他各段分别注射待试菌株肉汤培养物的滤液2mL。将腹壁缝合。

测定LT时，于注射后18小时剖腹检查

测定ST时，于注射后6—8小时剖腹检查

取出肠管分别抽取肠段的积液，测定其容量，并测定肠段的长度。积液量(mL)与肠段长度(cm)之比大于l者为阳性。

2）乳鼠灌胃试验：

2、双向琼脂扩散试验

将被检菌按5点环形接种于Elek氏培养基上，以同样操作共做两份，36±1℃培养48小时，在每株菌的菌苔上各放一片多粘菌素纸片，36+1℃经5—6时，使抗生素渗入琼脂中，在五点环形菌苔各5mm处的中央，挖一个直径4mm的园并用一滴琼脂垫底。在一份平板的孔内滴加LT抗毒素30ul，另一份平板的孔内滴加ST毒素30ul。放于36+1℃经15～20小时观察结果，在菌斑和抗毒素之间出现白色沉淀带为阳性，无沉淀带者为阴性。

（六）豚鼠角膜试验

供测定侵袭性大肠埃希氏菌用，将经过生化证实试验的待试菌株18—20小时琼脂培养物，用肉汤洗下，使成每lml含菌9亿个菌悬液，作为接种材料。

体重400--500g的健康豚鼠(角膜与结膜外观正常，并经细菌培养检查)的角膜上接种待试菌悬液1滴。

48小时后观察结果，结膜充血浮肿、角膜混浊、眼内充盈泪液或浆液性分物者为阳性，自结膜囊取样分离细菌，鉴定应与原接种菌一致。

（七）、结果报告

根据以上生化试验、血清学试验、肠毒素试验和豚鼠角膜试验的结果出报告，如果是产毒大肠埃希氏菌时应有肠毒素试验的结果；如果是侵袭性大肠埃希氏荫应有豚鼠角膜试验和血清学试验的结果；如果是肠致病性大肠埃希氏菌时应有血清学试验结果。

以上为第四章 食品中毒性微生物的检验前三节内容，本章共十四节。